董 曉，馮書堂，王紅軍*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

胚胎干細(xì)胞顯微注射對(duì)小鼠和豬胚胎發(fā)育影響的研究

董 曉1，馮書堂2*，王紅軍1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

旨在為小鼠和豬多能性干細(xì)胞嵌合體制作提供參考，探討胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells，ES/EG)顯微注射及受體胚胎發(fā)育時(shí)期等對(duì)胚胎發(fā)育的影響。對(duì)小鼠ES細(xì)胞和豬EG細(xì)胞分別進(jìn)行研究：(1)將小鼠ES細(xì)胞分別注入小鼠桑椹胚和囊胚，比較不同發(fā)育時(shí)期受體胚胎體外培養(yǎng)的發(fā)育率和孵化率，以及注射胚胎和未注射胚胎體外培養(yǎng)的發(fā)育率和孵化率。結(jié)果表明，顯微注射后的桑椹胚體外培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率分別為94.7%和70.2%，囊胚率分別為84.6%和80.8%，注射后桑椹胚體外培養(yǎng)發(fā)育率極顯著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚體外培養(yǎng)孵化率極顯著高于桑椹胚(P<0.01)；未注射胚胎(注射胚胎)的體外培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率分別為96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%)，未注射胚胎發(fā)育率極顯著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率極顯著高于未注射胚胎(P<0.01)。(2)將豬EG細(xì)胞分別注入豬桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚，比較不同發(fā)育時(shí)期受體胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎體外培養(yǎng)的孵化率，并對(duì)豬EG細(xì)胞顯微注射針和固定針的規(guī)格進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，顯微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率為67%，而顯微注射的孵化囊胚移植妊娠率為0，桑椹胚、早囊及囊胚移植后受體母豬妊娠率極顯著高于孵化囊胚(P<0.01)，由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植獲得了兩頭嵌合體仔豬；顯微注射和未顯微注射的豬胚胎其孵化率分別為47.54%和72.97%，未注射胚胎孵化率極顯著高于注射胚胎(P<0.01)。確定豬EG嵌合體制作過(guò)程中，注射針外徑約為30 μm，內(nèi)徑約為25 μm；固定針外直徑約為130～150 μm，內(nèi)徑約為40 μm。嵌合體制作時(shí)，胚齡宜早不宜遲，桑椹胚顯微注射更易操作，而且導(dǎo)入的時(shí)期較早，ES/EG細(xì)胞在嵌合體組織中可以有很高的貢獻(xiàn)率，故選擇桑椹胚進(jìn)行注射。在本試驗(yàn)條件下，顯微注射對(duì)小鼠胚胎發(fā)育影響不大，對(duì)豬胚胎影響較大，說(shuō)明豬胚胎顯微注射條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。

胚胎干細(xì)胞；嵌合體；顯微注射

自1981年首次建立胚胎干細(xì)胞以來(lái)[1-2]，胚胎干細(xì)胞(ES/EG)在現(xiàn)代生命科學(xué)及生物藥物的生產(chǎn)方面起著越來(lái)越重要的作用。2006年，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell，iPS)建立成功，在干細(xì)胞、表觀遺傳學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響，不僅是因?yàn)樗诨A(chǔ)研究方面的重要性，而且為人們帶來(lái)光明的應(yīng)用前景[3]。將iPS/ES/EG細(xì)胞導(dǎo)入植入前胚胎制備嵌合體證明其多能性和研究細(xì)胞分化機(jī)制的有效手段[4]。嵌合體是指細(xì)胞來(lái)源于兩個(gè)或兩個(gè)以上不同胚胎的動(dòng)物。嵌合體的制作是研究發(fā)育機(jī)理、基因表達(dá)機(jī)制、產(chǎn)生動(dòng)物新品種和制作疾病模型的有效手段[5]。制作動(dòng)物胚胎干細(xì)胞嵌合體常用的方法有兩種，即卵裂球聚合法和顯微注射法。卵裂球聚合法是將去除透明帶的4-～8-細(xì)胞胚胎或桑椹胚與多能干細(xì)胞共培養(yǎng)使其聚合在一起生長(zhǎng)，從而將多能干細(xì)胞導(dǎo)入受體胚胎的方法[6]。由于聚合法耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，多數(shù)試驗(yàn)采用顯微注射法制備嵌合體。顯微注射法首先采用的是囊胚注射法，是把一種或多種胚胎的卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、畸胎瘤干細(xì)胞(Embryonic carcinoma cells，EC)、ES/EG細(xì)胞等供體細(xì)胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中獲得嵌合體的方法[7-8]。桑椹胚注射法是把供體細(xì)胞注射到桑椹胚的透明帶與胚胎細(xì)胞腔隙中，使供體細(xì)胞與胚胎細(xì)胞共同發(fā)育形成嵌合體[9]。顯微注射法是制備iPS/ES/EG細(xì)胞嵌合體的經(jīng)典方法，該方法成功率高，但是整個(gè)過(guò)程精細(xì)復(fù)雜，從iPS/ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)、注射針/持胚針的制作、注射胚胎的收集、顯微注射、注射胚胎移植、嵌合體鑒定等，涉及很多技術(shù)環(huán)節(jié)，影響因素很多，迄今尚缺乏影響因素的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)探討了受體胚胎發(fā)育時(shí)期對(duì)ES/EG細(xì)胞注射后小鼠和豬胚胎發(fā)育的影響、顯微注射對(duì)小鼠和豬胚胎發(fā)育的影響，以及豬EG細(xì)胞顯微注射針的規(guī)格等，以期為小鼠和豬iPS/ES/EG細(xì)胞嵌合體的制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠ES細(xì)胞顯微注射

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 8～10 周齡的雌性昆明白小鼠，腹腔注射PMSG10 IU·只-1，間隔48 h腹腔注射hCG10 IU·只-1，與昆明白公鼠合籠，次日晨檢查陰道栓，見栓時(shí)按12 h計(jì)(試驗(yàn)所用昆明白小鼠購(gòu)自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.2 注射針、固定針及移胚管的制備 參考冼美薇的報(bào)道[10]。注射針制作：將外徑1.05 mm、內(nèi)徑0.8 mm的毛細(xì)玻璃管用拉針儀(Leitz，German)拉成細(xì)針，用煅燒儀斷成平口，而后在磨針儀(Narishige，Japan)上磨出45°斜面，再在煅燒儀上吊尖。小鼠ES注射針外徑約為20 μm，內(nèi)徑為12～15 μm。固定針制作：用酒精燈加熱毛細(xì)玻璃管，拉出一段細(xì)管，斷成平口，在火焰上灼燒端部，使其圓滑。固定針外徑約為100～120 μm，內(nèi)徑為25 μm(20～30 μm)。移胚管：內(nèi)徑為130～138 μm，外徑約200 μm。1.1.3 ES細(xì)胞的準(zhǔn)備 ES細(xì)胞由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胚胎干細(xì)胞中心饋贈(zèng)。選擇處于生長(zhǎng)旺盛狀態(tài)的ES細(xì)胞，按常規(guī)方法消化成單細(xì)胞懸液，接種至預(yù)先涂有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，置37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.0～1.5 h，取出培養(yǎng)皿，可觀察到飼養(yǎng)層細(xì)胞已經(jīng)貼壁，而狀態(tài)良好的ES細(xì)胞黏附在飼養(yǎng)層上，狀態(tài)不好的ES細(xì)胞和細(xì)胞碎片漂浮在培養(yǎng)液中。小心地吸去培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，將ES細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，飼養(yǎng)層細(xì)胞則留在皿底。這樣可得到去除了大部分飼養(yǎng)層細(xì)胞而且狀態(tài)良好的ES細(xì)胞。收集含ES細(xì)胞的培養(yǎng)液，1 000 r·min-1離心10 min，用少量ES細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞備用。也可以將培養(yǎng)皿中的ES細(xì)胞團(tuán)用細(xì)的撥針剝離下來(lái)，在0.25%Trypsin-0.04%EDTA液中消化，同時(shí)用吸管輕輕吹打，將ES集落外圍離散下來(lái)的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)塊迅速移入ES細(xì)胞培養(yǎng)液中。繼續(xù)用吸管輕輕吹打離散剩余的團(tuán)塊，如此反復(fù)，直至將大的ES集落都離散為單細(xì)胞和約含10 個(gè)細(xì)胞的小團(tuán)塊為止，將分批離散下來(lái)的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)塊移入ES培養(yǎng)液中，1 000 r·min-1離心10 min收集ES細(xì)胞，用少量ES細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞備用[10]。

1.1.4 受體小鼠胚胎的收集和培養(yǎng) 分別在妊娠2.5、3.5 d處死小鼠，取出子宮，用PBS+5%胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)CS)沖洗、收集桑椹胚和囊胚，用于ES細(xì)胞注射的受體胚胎。

1.1.5 顯微注射操作 取1滴PBS+10%FCS液在載玻片的注射小室中，用石蠟油覆蓋制成注射小滴；待注射胚胎在含5 μg·mL-1細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)的PBS+10%FCS胚胎培養(yǎng)液中處理5～10 min，用移胚管吸取6～8枚胚胎移入注射小滴中，用固定針吸附固定待注射胚胎，用注射針吸取5～10 個(gè)ES細(xì)胞或ES細(xì)胞小團(tuán)塊，注射入胚胎透明帶或囊胚腔中。

1.1.6 體外培養(yǎng) 注射后的胚胎在PBS液中清洗3遍，而后移入PBS+10%FCS培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄第4.5天的發(fā)育胚胎數(shù)和第5.5天的孵化胚胎數(shù)。未經(jīng)CB和注射處理的胚胎發(fā)育情況作為對(duì)照。

1.2 豬EG細(xì)胞顯微注射

1.2.1 固定針、注射針、移胚管的制備 固定針、注射針、移胚管的制備方法同1.1.2，只是豬試驗(yàn)用的固定針、注射針、移胚管內(nèi)徑要粗點(diǎn)。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物 五指山豬胎兒來(lái)自自然發(fā)情或經(jīng)超數(shù)排卵處理的性成熟母豬。超數(shù)排卵方法為肌肉注射PMSG1 000 IU·頭--1，隔72 h后肌肉注射hCG500 IU·頭--1，hCG注射24 h后進(jìn)行第1次配種，第2天進(jìn)行復(fù)配，配種的第1天記為0 d；注射受體胚來(lái)自大白豬(公豬)×長(zhǎng)楓白豬(母豬)；長(zhǎng)楓白豬或長(zhǎng)楓黑豬作為注射胚胎移植受體(所有試驗(yàn)用豬來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)。

1.2.3 豬PGC采集與培養(yǎng)傳代 原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGC)來(lái)自妊娠26～27 d的五指山豬胎兒生殖嵴。豬胎兒生殖嵴用PBS液沖洗數(shù)次，然后將其放在表面皿中用注射器的后柄充分研磨碎，加入新鮮PGC/EG培養(yǎng)液(DMEM+10%FCS)，將研磨碎的組織移入離心管中，用吸管充分吹打，靜置10 min，吸取上清液離心，用適量PGC/EG培養(yǎng)液重新懸浮含有PGC的沉淀，接種于預(yù)先鋪有STO飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，在38 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，逐天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，約4 d 細(xì)胞集落長(zhǎng)出，7 d 左右即可用0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液進(jìn)行常規(guī)消化傳代，直至獲得EG細(xì)胞系[11]。

1.2.4 受體豬胚胎的獲取 長(zhǎng)楓白豬發(fā)情周期的第16～17天，肌肉注射PMSG 1 000 IU·頭--1，72 h后注射HCG 500 IU·頭-1促排卵，次日發(fā)情的母豬用大白公豬配種，配種的第1天記為0 d。嵌合體制作時(shí)，分別在第5天(多為囊胚、早囊，少量為桑椹胚)和第6 天(此時(shí)大部分為孵化囊胚)手術(shù)法收集胚胎，用于EG細(xì)胞注射的受體胚胎。

1.2.5 注射用細(xì)胞的準(zhǔn)備 分別利用五指山小型豬新鮮PGC和第1～6代的EG細(xì)胞進(jìn)行顯微注射。其中EG細(xì)胞的準(zhǔn)備方法同1.1.3。

1.2.6 胚胎注射程序 欲注射胚胎在含5 μg·mL-1CB的PBS+10%FCS液中處理5～10 min。每個(gè)豬胚胎注射5～10 個(gè)EG細(xì)胞或EG細(xì)胞小團(tuán)塊，將注射完的胚胎移入PBS+10%FCS培養(yǎng)液中，在38 ℃，飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)1～3 h，使胚胎恢復(fù)。

1.2.7 體外培養(yǎng) 收集5 d豬胚胎(多為早囊和囊胚)注射EG細(xì)胞，胚胎在PBS液中清洗3遍移入PBS+10%FCS培養(yǎng)液中，置于38 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄第6 天的孵化胚胎數(shù)。未經(jīng)CB和注射處理的胚胎發(fā)育情況作為對(duì)照。

1.2.8 胚胎移植 選取發(fā)情時(shí)間比受體胚胎供體豬滯后1～2 d的長(zhǎng)楓白或長(zhǎng)楓黑母豬做注射胚胎受體豬。將注射了EG細(xì)胞的胚胎手術(shù)法移入受體母豬子宮。移植后需注意觀察受體母豬身體狀況及是否返情。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.01，表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠ES細(xì)胞顯微注射

本試驗(yàn)共收集168 枚小鼠胚胎，用于比較受體胚胎不同發(fā)育時(shí)期對(duì)注射ES細(xì)胞后小鼠胚胎體外發(fā)育的影響及顯微注射對(duì)胚胎體外發(fā)育的影響。注射前鼠胚胎、剛剛注射后鼠胚胎以及注射鼠胚胎體外培養(yǎng)后形態(tài)變化見圖1～3。經(jīng)顯微注射的桑椹胚體外培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率分別為94.7%(54/57)和70.2%(40/57)。囊胚(注射時(shí)多數(shù)為早期囊胚)體外培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率分別為84.6%(44/52)和80.8%(42/52)。注射后桑椹胚體外培養(yǎng)發(fā)育率極顯著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚體外培養(yǎng)孵化率極顯著高于桑椹胚(P<0.01)(表1)。未經(jīng)注射直接培養(yǎng)的胚胎(胚胎培養(yǎng)液為PBS+10%FCS)發(fā)育率為96.6%，孵化率為67.8%，注射ES的胚胎(注射前胚胎在PBS+10%FCS+5 μg·mL-1CB中處理5～10 min，胚胎培養(yǎng)液為PBS+10%FCS)發(fā)育率為89.9%，孵化率為75.2%。未注射胚胎發(fā)育率極顯著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率極顯著高于未注射胚胎(P<0.01)(表2)。

2.2 豬EG細(xì)胞顯微注射

豬EG注射針外徑約為30 μm，內(nèi)徑約為25 μm；固定針外徑約為130～150 μm，內(nèi)徑約為40 μm；移胚管內(nèi)徑為250 μm。

圖1 注射前鼠胚胎 200× Fig.1 Mouse embryos before microinjection 200×

圖2 剛注射后鼠胚胎 100×Fig.2 Mouse embryos just after ES microinjection 100×

圖3 注射后鼠胚胎體外培養(yǎng)后孵化(4.5 d) 200×Fig.3 Hatched mouse embryos after ES cell microinjection and in vitro culture(4.5 d) 200×

收集312 枚胚胎進(jìn)行15 次豬EG顯微注射及胚胎移植試驗(yàn)。為了保證受體母豬能夠妊娠，需移入足夠量的胚胎，采用每次每頭受體豬移植20多個(gè)胚胎，其中含約一半數(shù)目的未注射胚胎以促進(jìn)妊娠。結(jié)果只有1頭豬妊娠期滿產(chǎn)下8頭仔豬，其中兩頭證明為嵌合體[11]。選用了兩種胚胎用于EG細(xì)胞注射，一種是桑椹胚、早囊及囊胚，一種是孵化囊胚。桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植妊娠率為67%(4/6)，而孵化囊胚注射后移植妊娠率為0(0/5)，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，孵化囊胚不適宜注射制作嵌合體。表3為兩類胚胎注射后移植結(jié)果比較。圖4是豬囊胚的顯微注射，圖5是剛注射后豬胚胎狀態(tài)。收集98 枚5 d豬胚胎(多為早囊和囊胚)，用于比較顯微注射EG對(duì)豬胚胎體外發(fā)育的影響。從表4可以看出，顯微注射EG和未經(jīng)顯微注射的豬胚胎其孵化率分別為47.54%和72.97%，未注射胚胎孵化率極顯著高于注射胚胎(P<0.01)。

3 討 論

囊胚注射法是制備多能性干細(xì)胞嵌合體的經(jīng)典方法，但在豬的嵌合體制作中，發(fā)現(xiàn)豬的囊胚滋養(yǎng)層與透明帶變得較軟，易發(fā)生粘針、堵針情況，增加了操作難度。桑椹胚注射法僅需刺破透明帶即可將多能性干細(xì)胞導(dǎo)入胚胎內(nèi)部，與囊胚注射相比技術(shù)難度較低。由于導(dǎo)入的時(shí)期較早，多能干細(xì)胞在嵌合體的各種組織中有更高的貢獻(xiàn)率。本研究小鼠胚胎注射的結(jié)果表明，注射后桑椹胚體外培養(yǎng)發(fā)育率極顯著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚體外培養(yǎng)孵化率極顯著高于桑椹胚(P<0.01)。

陳偉勝等[12]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入的受體胚胎越早，形成嵌合體的嵌合程度越高，但嵌合體的獲得率低，原因是在小鼠桑椹胚顯微注射過(guò)程中，注射針有時(shí)對(duì)胚胎結(jié)構(gòu)破壞比較大。在本試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)注射胚胎的早期死亡多為注射時(shí)破壞較大所致，而破壞程度較小的則未對(duì)胚胎發(fā)育構(gòu)成影響，一方面胚胎早期生存能力較強(qiáng)，另一方面本試驗(yàn)用了細(xì)胞松弛素B(CB)起了很大作用，目前尚未見到用CB對(duì)胚胎處理制作胚胎干細(xì)胞嵌合體的報(bào)道，細(xì)胞松弛素作為細(xì)胞骨架松弛劑可以減弱細(xì)胞骨架基礎(chǔ)的堅(jiān)固性[13]，考慮到CB可以使細(xì)胞骨架松弛，降低注射對(duì)胚胎的危害作用，并且還有激活作用，增強(qiáng)胚胎的生存發(fā)育能力，所以嘗試使用處理注射胚胎，結(jié)果表明，未注射胚胎發(fā)育率極顯著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率極顯著高于未注射胚胎(P<0.01)。對(duì)照組未注射胚胎未經(jīng)CB處理，表明其在體外培養(yǎng)發(fā)育時(shí)未表現(xiàn)出明顯的發(fā)育優(yōu)勢(shì)，在孵化率方面甚至低于注射胚，用CB對(duì)胚胎處理5～10 min，對(duì)體外培養(yǎng)獲得的較高孵化率起了很大的作用，有關(guān)CB對(duì)嵌合體制作的影響還需要進(jìn)一步的研究。

表1 桑椹胚和囊胚注射ES細(xì)胞后體外發(fā)育情況

Table 1Invitrodevelopment of embryos after ES cell injection at morulae or blastocysts stages

胚期Embryonicstage胚胎數(shù)Embryonumber注射ES細(xì)胞數(shù)InjectedEScellnumber發(fā)育胚數(shù)Developedembryonumber孵化胚數(shù)Hatchedembryonumber發(fā)育率/%Developmentalrate孵化率/%Hatchabilityrate桑椹胚M(jìn)orula575～10544094．7A70．2B囊胚Blastocyst525～10444284．6B80．8A

同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01)，下同

Different capital letters(A&B) in the same column indicate significant difference between groups(P<0.01).The same as below

表2 顯微注射ES細(xì)胞對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育的影響

Table 2Invitrohatchability rates of ES cell-microinjected embryosand non-injected controls in mice

胚胎數(shù)Embryonumber注射ES細(xì)胞數(shù)InjectedEScellnumber發(fā)育胚數(shù)Developedembryonumber孵化胚數(shù)Hatchedembryonumber發(fā)育率/%Developmentalrate孵化率/%Hatchabilityrate1095～10988289．9B75．2A590574096．6A67．8B

表3 桑椹胚、早囊及囊胚與孵化囊胚注射EG細(xì)胞后移植結(jié)果

Table 3 Developmental abilities of pig embryos derived from EG cells injected into morulae，early blastocysts，blastocysts or hatched blastocysts

組別Group胚胎數(shù)EmbryoNo．受體豬數(shù)No．ofrecipient移植胚胎數(shù)/頭Transplantedperrecipient妊娠數(shù)No．ofpregnant分娩數(shù)No．ofdelivered妊娠率/%Pregnancyrate分娩率/%Deliveryrate桑椹胚、早囊及囊胚M(jìn)，EB，B1866314167A17A孵化囊胚HB126525000B0B

M.桑椹胚；EB.早囊；B.囊胚；HB.孵化囊胚

M.Morula;EB.Early blastocyst;B.Blastocyst;HB.Hatched blastocyst

表4 顯微注射EG細(xì)胞對(duì)豬胚胎體外發(fā)育的影響

Table 4Invitrohatchability rates of EG cell-microinjected embryosand non-injected controls

胚胎數(shù)Embryonumber注射EG細(xì)胞數(shù)InjectedEGcellnumber孵化數(shù)Hatchedembryonumber孵化率/%Hatchabilityrate615～102947．54B3702772．97A

圖4 豬囊胚的顯微注射 100×Fig.4 Microinjection of pig blastocyst 100×

圖5 剛注射后豬胚胎 100×Fig.5 Pig embryos right after EG cell microinjection 100×

豬在異種器官移植等方面有巨大潛在價(jià)值，隨著iPS/ES/EG細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因途徑的建立及基因定點(diǎn)敲除技術(shù)的不斷發(fā)展，豬的iPS/ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)和嵌合體制作等研究一直是近年科研熱點(diǎn)。迄今國(guó)際上僅有4 個(gè)團(tuán)隊(duì)獲得了豬EG細(xì)胞嵌合體[9，11，14-16]，只有L.R.Chen等[17]獲得了豬ES嵌合體，后來(lái)有報(bào)道獲得了iPS嵌合豬和種系嵌合體豬[18-19]，但在豬iPS/ES/EG細(xì)胞嵌合體制作影響因素方面探討很少。顯微注射操作技術(shù)性比較強(qiáng)。本研究在小鼠顯微注射針和固定針制作方法和規(guī)格上主要參考文獻(xiàn)[10，20]中固定針、注射針的制作方法。在豬的嵌合體制作方面，只有S.Mueller等[16]提到注射時(shí)采用的固定針內(nèi)徑為130～140 μm，注射針內(nèi)徑為20 μm[16]。豬的囊胚直徑約為150 μm，最終將固定針外徑定為130～150 μm，內(nèi)徑定為40 μm；豬EG細(xì)胞的直徑為5～15 μm，但由于豬EG細(xì)胞黏性較強(qiáng)，增大了吸取EG細(xì)胞的難度，所以將注射針的直徑定為25 μm。

導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞數(shù)目也會(huì)影響到嵌合胚發(fā)育，導(dǎo)入細(xì)胞數(shù)太少則嵌合率低，過(guò)多則易導(dǎo)致發(fā)育異常，在孕中期被吸收。小鼠的ES嵌合體制作，一般注射5～10 個(gè)[12]或者10～15 個(gè)ES細(xì)胞既可有較高正常發(fā)育率又可有較高的嵌合體形成率[8]。前期試驗(yàn)結(jié)果證明，注射量在5～10 個(gè)ES細(xì)胞比較合適[21]。在豬的EG嵌合體制作中，EG細(xì)胞注射量10～30 個(gè)[9，14]、PGC注射量5～15 個(gè)[15-16]均有報(bào)道，本試驗(yàn)在小鼠試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)注射小團(tuán)塊約含5～10 個(gè)EG細(xì)胞。本試驗(yàn)也曾采用新鮮豬PGC、培養(yǎng)24 h的豬PGC用于注射，但未獲得嵌合體。而獲得嵌合體的EG細(xì)胞注射時(shí)已培養(yǎng)到第6代，這些EG細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明EG細(xì)胞狀態(tài)對(duì)嵌合體發(fā)育影響也很大。

在本試驗(yàn)中，分別注射兩種不同發(fā)育階段的豬胚胎，結(jié)果表明在桑椹胚、早期囊胚及囊胚這一階段時(shí)，注射后移植受體母豬妊娠率較高，而在孵化囊胚階段注射后移植妊娠率很低。所獲嵌合體豬就來(lái)自桑椹胚、早囊及囊胚注射胚胎。在這一階段，EG細(xì)胞可在胚胎發(fā)育中有更大的貢獻(xiàn)[11]。本研究在豬的試驗(yàn)過(guò)程中采用的是和小鼠胚胎注射時(shí)相同的條件，都是用CB預(yù)處理10 min，但是卻沒(méi)有收到在小鼠試驗(yàn)中的效果，因?yàn)樨i胚胎體外培養(yǎng)要求條件更高，還需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究確定了豬EG嵌合體制作過(guò)程中，注射針外徑約為30 μm，內(nèi)徑約為25 μm；固定針外徑約為130～150 μm，內(nèi)徑約為40 μm。嵌合體制作時(shí)胚齡宜早不宜遲，桑椹胚顯微注射更易操作，而且導(dǎo)入的時(shí)期越早，ES/EG細(xì)胞在嵌合體組織中會(huì)有更高的貢獻(xiàn)率，所以可以選擇桑椹胚進(jìn)行注射。在本試驗(yàn)條件下，顯微注射對(duì)小鼠胚胎發(fā)育影響不大，但是對(duì)豬胚胎影響較大，豬胚胎顯微注射條件需要進(jìn)一步優(yōu)化。

[1] EVANS M J，KAUFMAN M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature，1981，292(5819)：154-156.

[2] MARTIN G R.Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J].ProcNtlAcadSciUSA，1981，78(12)：7634-7638.

[3] TAKAHASHI K，YAMANAKA S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell，2006，126(4)：663-676.

[4] 白照岱，沈 和.胚胎干細(xì)胞嵌合體小鼠的制備及其影響因素[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2007，16(6)：444-447. BAI Z D，SHEN H.Generation of mouse chimeras from embryonic stem cell and influencing elements involved[J].JournalofReproductiveMedicine，2007，16(6)：444-447.(in Chinese)

[5] 郭志勤.家畜胚胎工程[M].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1998：209-211. GUO Z Q.Livestock embryo engineering[M].Beijing：Chinese Science and Technology Press，1998：209-211.(in Chinese)

[6] NAGY A，GERT S M，VINTERSTEN K，et al.Manipulating the mouse embryo：a laboratory manual[M].New York：Cold Spring Harb or Laboratory Press，2003：112．

[7] STEWART C L，GADI I，BHATT H.Stem cells from primordial germ cells can reenter the germline[J].Development，1994，161：626-634.

[8] ROBERT A T，BENJAMIN E L，SHANNON L B，et al.The perfect host：a mouse host embryo facilitating more efficient germ line transmission of genetically modified embryonic stem cells[J].PLoSONE，2013，8(7)：e67826.

[9] RUI R，SHIM H，MOYER A L，et al.Attempts to enhance production of porcine chimeras from embryonic germ cells and preimplantation embryos[J].Theriogenology， 2004，61：1225-1235.

[10] 冼美薇，吳白燕，胡新立，等.通過(guò)顯微注射法構(gòu)建ES細(xì)胞(MESPU13)嵌合小鼠[J].遺傳，1996，18(1)：7-10. XIAN M W，WU B Y，HU X L，et al.Construction of chimeric mice of ES cells by microinjection method[J].Hereditas(Beijing)，1996，18(1)：7-10.(in Chinese)[11] DONG X，TSUNG H C，MU Y L，et al.Generation of chimeric piglets by injection of embryonic germ cells from inbred Wuzhishan miniature pigs into blastocysts Generation of chimeric piglets by injection of embryonic germ cells from inbred Wuzhishan miniature pigs into blastocysts[J].Xenotransplantation， 2014，21：140-148.

[12] 陳偉勝，韓 嶸，尚克剛.小鼠ES細(xì)胞種系嵌合體的獲得[J].遺傳學(xué)報(bào)，1999，26(2)：126-134. CHEN W S，HAN R，SHANG K G.Formation of germline chimeras from murine embryonic stem cell lines[J].ActaGeneticaSinica，1999，26(2)：126-134.(in Chinese)

[13] FUJIHIRA T，KISHIDA R，F(xiàn)UKUI Y.Developmental capacity of vitrified immature porcine oocytes following ICS I：effects of cytochalasin B and cryoprotectants[J].Cryobiology，2004，49：286-290.

[14] SHIM H，GUTIERREZ A A，CHEN L R，et al.Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells[J].BiolReprod，1997，57：1089-1095.

[15] PISDRAHITA J A，MOORE K，OETAMA B，et al.Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies[J].BiolReprod， 1998，58：1321-1329.

[16] MUELLER S，PRELLE K，RIEGER N，et al.Chimeric pigs following blastocyst injection of transgenic porcine primordial germ cells[J].MolReprodDev，1999，54：244-254.

[17] CHEN L R，SHIUE Y L，BERTOLINI L，et al.Establishment of pluripotent cell lines from porcine preimplantation embryos[J].Theriogenology， 1999，52：195-212.

[18] FRANKLIN D W，ELIZABETH W U，YUBING L，et al.Chimeric pigs produced from induced pluripotent stem cells demonstrate germline transmission and no evidence of tumor formation in young pigs[J].StemCells，2011，29：1640-1643.

[19] SHUH-HEI F，KAZUAKI N，YOSHIHISA M，et al.Generation of naive-like porcine-induced pluripotent stem cells capable of contributing to embryonic and fetal development[J].StemCellsDev，2013，22：473-482.[20] 陳大元.受精生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2003：387-388. CHEN D Y.Fertilization biology[M].Beijing：Science Press，2003：387-388.(in Chinese)

[21] 周作紅，陳紅平.顯微注射胚胎干細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠胚胎發(fā)育的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(6)：839-842. ZHOU Z H，CHEN H P.Effects of microinjection of embryonic stem cells on development of mouse embryos[J].ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis，2004，26(6)：839-842.(in Chinese)

(編輯 程金華)

Analysis of Factors Influencing Embryonic Development after Mouse or Pig Embryonic Stem Cells or Embryonic Germ(ES/EG) Mircoinjection

DONG Xiao1，F(xiàn)ENG Shu-tang2*，WANG Hong-jun1*

(1.CollegeofLifeScience，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China； 2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The goal of this study was to assess how different microinjection conditions influence chimeras production after ES/EG cells injection into embryos in mouse and pig.Mouse ES cells were micrioinjected into embryos at morula or blastocyst stages.Hatching rate and blastocyst rate after cell injections were measuredinvitro.Non-injected embryos were used as controls.In mouse，embryos showed significant higher developmental rate when ES cells were injected into morulae compared to those injected into blastocysts(P<0.01).In contrast，cells injected into blastocysts had higher hatchability than those injected into morulae(P<0.01).Compared to non-injected controls，ES cell injected embryos had higher hatchability but lower developmental rate afterinvitroculture(P<0.01).We further assessed porcine embryonic development after EG cells microinjection into morulae，early blastocysts，blastocysts，or hatched blastocysts，and we also investigated the optimal injecting/ holding pipette sizes for pig EG cell microinjection.Our data showed that pregnancy rates of EG cells microinjected into morulae，early blastocysts，or blastocysts，were significant higher than those injected into the hatched blastocysts(P<0.01).The hatched rate was significantly lower in microinjected embryos compared to non-injected controls(P<0.01).Two chimeric piglets were obtained after embryo transfer.In addition，we found that the optimal inner and outside diameters for pigs EG microinjection were 25 and 30 μm for the injecting pipette，and 40 μm and 130-150 μm for the holding pipette，respectively.Upon comparison of different conditions，we determined optimal injecting/holding pipette sizes for pig EG cell injection.Furthermore，ES/EG cells microinjection into morulae could achieve higher contribution rate in chimera.Microinjection had lower impact on mouse embryonic development compared to pig，suggesting that pig embryonic microinjection condition has to be further optimized.

embryonic stem cells；chimera；microinjection

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.011

2015-02-11

山東省“泰山學(xué)者海外特聘專家”啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(6631111314)；山東省自然基金2014年面上項(xiàng)目(ZR2014CM011)

董 曉(1969-)，女，山東人，副教授，博士，主要從事干細(xì)胞與干細(xì)胞治療研究，E-mail：1163155358@qq.com

*通信作者：王紅軍，教授，E-mail：hjwang11@hotmail.com；馮書堂，研究員，E-mail：fst508@sina.com

Q28

A

0366-6964(2015)10-1784-07