牛玉娟，馬海營(yíng)，張振東，呂傳位，朱明霞，劉思當(dāng)*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018；2.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059；3.山東鳳祥股份有限公司，陽(yáng)谷 252300)

新城疫疫苗毒和低致病性禽流感病毒感染SPF雞炎癥因子的變化

牛玉娟1，馬海營(yíng)1，張振東1，呂傳位1，朱明霞2，3*，劉思當(dāng)1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018；2.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059；3.山東鳳祥股份有限公司，陽(yáng)谷 252300)

旨在探討炎癥因子(白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子α)與氣管黏膜分泌型免疫球蛋白A (SIgA)的變化是否可作為雞呼吸道病的判定及預(yù)警指標(biāo)。通過(guò)新城疫(ND)LaSota 疫苗毒和低致病性禽流感病毒(H9N2)單獨(dú)及混合感染SPF雛雞，造成呼吸道感染，采用雙抗體夾心 ELISA 法對(duì) SPF 雞血清和氣管沖洗液中炎癥因子及SIgA的含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，分析其數(shù)量變化與呼吸道病癥之間的內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果表明：ND LaSota 疫苗毒和低致病性禽流感 H9N2經(jīng)呼吸道接種 SPF雛雞后，會(huì)迅速出現(xiàn)呼吸道癥狀及炎癥反應(yīng)，炎癥因子及黏膜抗體的含量較對(duì)照組顯著升高；兩病毒感染后引起的5種炎癥因子含量的變化具有明顯的時(shí)間差異；血清與氣管沖洗液中炎癥因子的變化大致相同，但是沖洗液5種炎癥因子的含量變化更加敏感。所研究5種炎癥因子的變化與雞呼吸道感染的病程及病情均密切相關(guān)，借助炎癥因子(尤其是IL-8)的檢測(cè)有助于確定呼吸道炎癥的發(fā)生及嚴(yán)重程度，對(duì)雞呼吸道病的判定及預(yù)警具有重要的參考價(jià)值。

雞；呼吸道疾病；炎癥因子；診斷；預(yù)警

肉雞呼吸道疾病嚴(yán)重危害肉雞業(yè)的健康發(fā)展，在很多規(guī)模化雞場(chǎng)，其造成的損失占整個(gè)疾病損失的一半以上。此病被稱為多病因呼吸道疾病(multicausal respiratory disease，MRD) 或呼吸道綜合征(respiratory syndrome)。雞呼吸道疾病是在應(yīng)激誘發(fā)因素作用下由眾多病原微生物參與引起的炎性疾病，在病理上主要表現(xiàn)卡他性、出血性卡他性、纖維素性炎癥，在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有眾多炎癥因子參與，局部黏膜抗體對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)揮重要作用。

有研究報(bào)道檢測(cè)血清中炎癥因子的濃度，能幫助診斷某種特定病原造成的呼吸道感染性疾病，同時(shí)也能評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度[1-9]。本課題擬通過(guò)檢測(cè)白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)及氣管黏膜分泌型免疫球蛋白A (SIgA)在呼吸道疾病發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)定量變化，探討5種炎癥因子在呼吸道疾病中的產(chǎn)生及消長(zhǎng)規(guī)律，分析其與雞呼吸道疾病的相關(guān)性，為呼吸道疾病的診斷、預(yù)警及程度判定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚，購(gòu)自濟(jì)南家禽研究所，孵化出殼后飼養(yǎng)至10日齡時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 病原 ND LaSota 株弱毒苗(1 000 羽份·瓶-1，NDV 的含量為 106.0EID50·羽份-1)，購(gòu)自鄭州康沃生物技術(shù)有限公司，批號(hào)(2010)160122007，按說(shuō)明書稀釋使用；H9N2低致病性禽流感病毒(106.0EID50·0.1 mL-1)由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.1.3 試劑 雞的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA ELISA 試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPF雞呼吸道感染方法 60羽10日齡SPF雛雞隨機(jī)分為4組(A、B、C、D)，每組15羽，A組以1×106EID50劑量的ND LaSota弱毒苗滴鼻，B組以106EID50·0.1 mL-1的H9N2 AIV滴鼻0.2 mL，C組按照A和B組的方法與劑量減半同時(shí)接種，D組為對(duì)照組接種滅菌 1%BSA-PBS 溶液。上述各組SPF雞于負(fù)壓隔離器內(nèi)分籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.2.2 臨床癥狀觀察 每天觀察各組SPF雞的臨床癥狀，記錄呼吸道感染情況。

1.2.3 血清和氣管灌洗液采集 試驗(yàn)雞于病毒接種后第1、2、3、4和6天，每組每次隨機(jī)取3只SPF雛雞，翅靜脈采血1 mL，血凝后 3 000 r·min-1離心5 min，收集血清；取出整條氣管，用止血鉗夾住兩端，然后將輸液器末端的細(xì)軟管插入氣管喉頭端，用5.0 mL冰冷的1%BSA-PBST溶液緩緩沖洗氣管腔，并反復(fù)沖洗10次，獲得的沖洗液經(jīng)3 000 r·min-1離心5 min，取上清即為氣管洗液，血清和灌洗液于-20 ℃凍存待檢。

1.2.4 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA含量檢測(cè) 按照IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)在 Microsoft Office Excel 上擬合曲線，計(jì)算待測(cè)樣品含量。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)雞的臨床表現(xiàn)

由表1可見，A組第1天(24 h)有1只雞出現(xiàn)呼吸道癥狀，表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸啰音；第3天大都出現(xiàn)呼吸道癥狀(7/9)，但程度不同，有的表現(xiàn)為呼嚕、咳嗽，呼吸啰音，有的表現(xiàn)呼吸困難、張口呼吸；之后癥狀雞的數(shù)量有所下降，仍保持較高的比例(2/3)，癥狀與第3天相似；到第6天時(shí)剩余的3只雞中有1只已無(wú)任何呼吸困難表現(xiàn)，另外2只的癥狀稍有緩和，仍在呼嚕。B組出現(xiàn)呼吸道癥狀的時(shí)間較其他攻毒組晚，但發(fā)病雞的比例在不斷上升，到第6天有癥狀雞達(dá)100%(3/3)。最初僅表現(xiàn)輕微的呼嚕聲，后期咳嗽，并見明顯的呼吸啰音。C組也是24 h之后出現(xiàn)了呼吸道癥狀，隨后癥狀雞的比例持續(xù)上升，第6天時(shí)100%(3/3)的剩余雞出現(xiàn)呼吸道癥狀，并見明顯的咳嗽及張口呼吸。

2.2 試驗(yàn)雞炎癥因子含量檢測(cè)與分析

2.2.1 血清炎癥因子含量檢測(cè)與分析 由表2可以看出，對(duì)照組的雞血清中4種炎癥因子的水平始終保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，變化幅度很小。

表1 試驗(yàn)雞感染發(fā)病情況

Table 1 The result of infection of test chickens

組別Groupn鼻腔攻毒Nasalchallenge劑量/mLDose各時(shí)間點(diǎn)呼吸道癥狀雞的比例Rateofchickenswithrespiratorysymptomsatvariouspoints第1天The1stday第2天The2ndday第3天The3rdday第4天The4thday第6天The6thdayA15LaSota弱毒苗0.21/153/127/94/62/3B15H9N2禽流感毒0.20/152/125/95/63/3C15H9N2+LaSota0.22/153/126/95/63/3D151%BSA-PBS0.20/150/120/90/60/3

pg·mL-1

*.顯著差異(P<0.05)，下表同

*.P<0.05，the same as below

3個(gè)攻毒組在第1天，4種炎癥因子的含量均有所升高，除A組IL-6的含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)外，均差異不顯著；在第3天4種炎癥因子含量均達(dá)到高峰，之后均呈下降趨勢(shì)，含量仍高于對(duì)照組。IL-1的含量A組在攻毒后第2、3和4天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；B組在攻毒后第3、4和6天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而C組只在第3天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。IL-6的含量A組在攻毒后第1、2、3和4天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；B組在攻毒后第3、4和6天顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；C組與B組相似。IL-8的含量A組和C組在攻毒后第2、4和6天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，B組則在第2、3和4天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。TNF-α的含量A組在攻毒后第2、3天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，B組和C組在攻毒后第3天顯著增高(P<0.05)。A組4種炎癥因子顯著升高的時(shí)間大都早于B組和C組。

2.2.2 氣管灌洗液炎癥因子含量檢測(cè)與分析 由表3可以看出，各試驗(yàn)組病毒感染第1天檢測(cè)，氣管灌洗液 IL-1、IL-6、IL-8 及TNF-α含量均明顯升高，SIgA在前4 d與對(duì)照組沒有區(qū)別，6 d時(shí)含量突然升高。血清和氣管灌洗液中IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α變化規(guī)律基本相同，在感染后第3 天炎癥因子的表達(dá)量最高。但與血清相比氣管灌洗液炎癥因子的變化更加迅速。對(duì)照組氣管灌洗液中炎癥因子和黏膜抗體含量很低，不在試劑盒檢測(cè)范圍之內(nèi)。

pg·mL-1

-.未檢出

-.Not detected

2.2.3 血清與氣管灌洗液中炎癥因子的比較 血清與氣管灌洗液中炎癥因子的比較結(jié)果顯示，血清中炎癥因子的水平通常比氣管灌洗液的水平低，但兩者的變化規(guī)律基本相似(圖1)。

圖1 血清和氣管灌洗液中IL-1的含量比較Fig.1 Comparison of the factors IL-1 in serum and bronchoalveolar lavage fluid

3 討 論

自然條件下，雞群人工感染低致病性禽流感(H9N2)病毒或者接種LaSota疫苗毒通常不會(huì)引起雞群明顯發(fā)病，而該試驗(yàn)接種SPF雛雞后迅速出現(xiàn)呼吸道癥狀，這可能與SPF雛雞無(wú)母源抗體保護(hù)有關(guān)。SPF雞對(duì)低致病性禽流感病毒和LaSota疫苗毒高度敏感，便于臨床癥狀的觀察，為雞呼吸道病模型的建立以及探究炎癥因子與呼吸道病癥的內(nèi)在聯(lián)系奠定了良好的基礎(chǔ)。

LaSota 疫苗毒進(jìn)入 SPF 雛雞體內(nèi)后24 h內(nèi)就有呼吸道癥狀出現(xiàn)，說(shuō)明LaSota疫苗毒對(duì)于 SPF雛雞具有一定的致病性。疫苗毒引起的呼吸道病發(fā)病急、病程短；H9N2禽流感病毒感染則發(fā)病緩、病程長(zhǎng)；混合感染組發(fā)病急且病程長(zhǎng)，兼有兩者之特點(diǎn)，提示在生產(chǎn)實(shí)踐中，倘若雞群中存在 H9N2 禽流感病毒隱性感染，當(dāng)用 ND 疫苗免疫時(shí)，可能會(huì)使雞群暴發(fā)呼吸道疾病。

各試驗(yàn)組血清和氣管灌洗液中IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的含量當(dāng)天就有明顯升高，在第3天均達(dá)高峰，與一些研究結(jié)果[10-11]類似。炎癥因子的變化較呼吸道癥狀出現(xiàn)得早、規(guī)律性強(qiáng)、便于量化檢測(cè)，因而炎癥因子可作為呼吸道感染早期的判定指標(biāo)，據(jù)變化的量化指標(biāo)可以推測(cè)炎癥的反應(yīng)程度。研究發(fā)現(xiàn)4種因子水平呈正相關(guān)，表明在病毒感染性炎癥的過(guò)程中IL-8、IL-6、IL-1及TNF-α協(xié)同發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，跟其他研究結(jié)果一致[12]。綜合4種炎癥因子的變化，IL-6和IL-8在呼吸道感染過(guò)程中變化最為顯著、相關(guān)性最強(qiáng)。

雞體對(duì)抗NDV和H9N2感染的免疫應(yīng)答在內(nèi)容上可分為體液和細(xì)胞免疫，在方式上可分為全身免疫和局部免疫。他們一方面以其特有的方式參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，另一方面又協(xié)同發(fā)揮作用。最初免疫反應(yīng)主要發(fā)生于感染局部的黏膜。病毒侵入呼吸道黏膜后首先被巨噬細(xì)胞為主的抗原遞呈細(xì)胞捕獲，一方面對(duì)其加工處理、濃集抗原決定簇于細(xì)胞表面；另一方面釋放出IL-1，激活的Th細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞亞群)，分泌釋放多種炎癥因子參與細(xì)胞免疫并促進(jìn)體液免疫。另外，具有一定毒力的病毒感染導(dǎo)致的黏膜局部炎癥或全身性炎癥反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致上述炎癥因子的大量產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，SIgA的升高遠(yuǎn)晚于4種炎癥因子的升高，他人的研究報(bào)道也得出了類似的結(jié)果[14-15]。

通過(guò)ELISA方法檢測(cè)炎癥因子的變化，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，能定量反映炎癥變化，炎癥因子變化的時(shí)間遠(yuǎn)早于臨床表現(xiàn)、病理變化及免疫抗體的產(chǎn)生，是判定呼吸道炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。可以運(yùn)用此方法對(duì)雞群呼吸道炎癥的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，炎癥因子的變化幅度較大時(shí)，意味著可能即將發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道炎癥，應(yīng)引起高度重視，具有重要的警示作用。但是此方法也有不足之處：1)炎癥因子的變化沒有特異性，不能具體判定是何種病原導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)；2)血清中的炎癥因子是全身性炎癥的綜合表現(xiàn)，無(wú)法定位炎癥部位；3)黏膜抗體含量的高低不能反映呼吸道感染的嚴(yán)重性。

4 結(jié) 論

初步證明IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和SIgA 5種炎癥因子的變化與雞呼吸道感染的病程及病情均密切相關(guān)，借助炎癥因子尤其是IL-8的檢測(cè)可有助于確定呼吸道炎癥的發(fā)生及嚴(yán)重程度，對(duì)雞呼吸道病的判定及預(yù)后具有重要價(jià)值。

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(編輯 白永平)

The Changes of Inflammatory Factors in SPF Chicken infected by LaSota live Vaccine and H9N2 Influenza Virus

NIU Yu-juan1，MA Hai-ying1，ZHANG Zhen-dong1，Lü Chuan-wei1，ZHU Ming-xia2，3*，LIU Si-dang1*

(1.ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.AgriculturalCollegeofLiaochengUniversity，Liaocheng252059，China；3.ShandongFengxiangGroupLimitedLiabilityCompany，Yanggu252300，China)

The aim of the present study was to investigate if the changes of inflammatory cytokines (interleukin 1，interleukin 6，interleukin 8，tumor necrosis factor alpha) and tracheal washing liquid and trachea mucosal secretory immunglobulin A (SIgA) can be used as judgments or warning indicators of respiratory diseases.We established a respiratory diseases model by infecting SPF chickens with Newcastle disease LaSota live vaccine and low pathogenic influenza virus (H9N2) single or mixed.Inflammatory factors of serum and SIgA were measured by double antibody sandwich ELISA method to analyze the inner relationship between the quantity changes and respiratory diseases.The results showed that SPF chickens appeared respiratory symptoms after inoculating LaSota vaccine and H9N2 AIV，content of inflammatory factors and mucosal antibody became significantly higher than those in control group，the changes of five cytokines content induced by two viral infection had obvious differences with time going，inflammation mediums became roughly same while the content in serum were less than in washing liquid.Pathological changes of chicken respiratory tract infection were closely related to the changing process of five inflammatory factors.With the help of detection of inflammatory factors，especially the IL-8，the severity of respiratory tract inflammation could be identified，so the detection of its content would have important reference value for the judgment of respiratory illness and early warning.

chicken；respiratory diseases；inflammatory factors；diagnosis；prediction

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.019

2014-07-31

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J14LF03)；博士后自選課題

牛玉娟(1989-)，女，山東濟(jì)寧人，碩士生，主要從事病理學(xué)研究，E-mail:yujuanniu@163.com

*通信作者：朱明霞，E-mail：1538054669@qq.com；劉思當(dāng)，E-mail：liusid@sdau.edu.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)04-0644-06