余長松，賈 剛，鄧秋紅，陳小玲，趙 華，劉光芒，王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，雅安 625014)

胰高血糖素樣肽-2對脂多糖應(yīng)激的IPEC-J2細胞形態(tài)和緊密連接相關(guān)基因表達的影響

余長松，賈 剛*，鄧秋紅，陳小玲，趙 華，劉光芒，王康寧

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，雅安 625014)

本研究旨在考察胰高血糖素樣肽-2(Glucagons-like peptide-2，GLP-2)和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)對仔豬空腸上皮細胞及其緊密連接(Tight Junctions，TJ)相關(guān)蛋白基因表達的影響，并探討GLP-2調(diào)控仔豬腸道TJ蛋白基因表達可能的作用機理。試驗一設(shè)對照、GLP-2、LPS、LPS+GLP-2 共4個組，考查各處理對IPEC-J2細胞形態(tài)和緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因表達的影響。結(jié)果：添加100 nmol·L-1GLP-2能顯著改善IPEC-J2細胞形態(tài)，顯著提高Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(P<0.01)；100 μg·mL-1LPS處理能顯著破壞細胞形態(tài)、降低IPEC-J2細胞緊密連接蛋白mRNA的表達(P<0.01)；在添加LPS基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2能有效維護細胞形態(tài)，顯著增加IPEC-J2細胞TJ相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(P<0.01)，增加量分別為46.3%、65.1%和30.3%。試驗二考察了添加PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)阻斷PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑后Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA表達量的變化，試驗共設(shè)對照、GLP-2、GLP-2+Wort、GLP-2+LY等4個組。結(jié)果：添加抑制劑Wort后可顯著降低IPEC-J2細胞Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(P<0.01)，降低量分別為46.9%、50.5%，38.1%、49.6%和18.9%；添加 LY后上述mRNA的表達量分別顯著降低了67.2%、70.8%，49.6%、60.9%和25.8%(P<0.01)。以上結(jié)果表明：添加GLP-2能夠有效抑制LPS應(yīng)激對IPEC-J2細胞形態(tài)和TJ相關(guān)基因表達的損傷，PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑可能是GLP-2調(diào)控腸道緊密連接蛋白基因表達的重要信號通路之一。

胰高血糖素樣肽-2；脂多糖；仔豬空腸上細胞IPEC-J2；緊密連接；PI3K-Akt-mTOR

仔豬斷奶時受到的應(yīng)激，特別是免疫應(yīng)激，能對仔豬腸道緊密連接(TJ)以及屏障功能產(chǎn)生不利影響，進而嚴重地影響到仔豬健康以及生產(chǎn)性能[1-3]。斷奶應(yīng)激導致仔豬腸道屏障功能受損與腸道TJ表達水平下降以及蛋白結(jié)構(gòu)重排有重要關(guān)系[4]。GLP-2屬于胰高血糖素原衍生肽類，其氨基酸序列在哺乳動物中具有高度的保守性[5-6]，能通過多條細胞信號轉(zhuǎn)導途徑最終促進正常小腸的生長和病理性腸黏膜的恢復(fù)[7]。GLP-2不僅能夠有效促進腸道細胞的增殖、分化，抑制細胞的凋亡[8-9]，還能降低腸道上皮細胞的通透性，提高腸道的屏障功能[10-11]。 PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑是參與調(diào)控腸道TJ表達和屏障功能的一條重要途徑，同時也是GLP-2調(diào)控細胞增殖和凋亡的重要細胞信號轉(zhuǎn)導途徑[12-13]。然而，也有研究表明GLP-2在調(diào)控部分細胞的增殖和生長中并沒有通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑[14]。因此，在仔豬腸上皮細胞中，GLP-2能否通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑，上調(diào)下游TJ蛋白基因的表達尚不清楚，有待深入研究。IPEC-J2細胞作為未分化的細胞系，建立于仔豬空腸上皮，能準確代表正常生理情況下的斷奶仔豬腸上皮細胞，而脂多糖(LPS)是仔豬斷奶過程中造成免疫應(yīng)激的一種重要誘發(fā)因子，是引起細胞免疫損傷的常用誘發(fā)劑[15]。

本試驗將以仔豬空腸上皮細胞IPEC-J2為模型，探究GLP-2對LPS應(yīng)激的IPEC-J2細胞形態(tài)和TJ基因表達的保護效應(yīng)，探討GLP-2是否通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控TJ基因的表達，研究結(jié)果可幫助人們認識腸道損傷、腸道屏障功能變化的分子機制，也為今后應(yīng)用GLP-2改善腸道屏障功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、主要試劑及儀器

IPEC-J2細胞系，建立于出生后24 h內(nèi)的仔豬空腸上皮細胞。由丹麥哥本哈根大學生命科學院人類營養(yǎng)系Per Sangild教授惠贈。

GLP-2(純度≥95%，Phoenix pharmaceuticals，美國)；LPS (Sigma，L2880)；Wortmannin (Beyotime，S1952)；LY294002(Beyotime，S1737)；胰島素(Sigma，I5500)；EGF(Peprotech，100-15)；ITS-G(Gibco，41400-045)；Trizol(TaKaRa)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)；實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純或者進口分裝試劑。

Ⅱ型注水式CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo)、1300-SERIES-A2生物安全柜(Thermo)、A200型倒置相差多功能生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置(Zeiss)、RT-PCR儀(Effendorf)、CFX-96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、DU520分光光度計(Beckman)、UV-1100/1200紫外可見分光光度計(上海美譜達)等。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗一采用單因子設(shè)計，共設(shè)4個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1孔，詳見表1。試驗二采用單因子設(shè)計，共設(shè)4個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1孔，詳見表2。

表1 試驗1設(shè)計方案

Table 1 The design of trial 1

處理Treatment對照組ControlLPS處理組LPSGLP-2處理組GLP-2LPS+GLP-2處理組LPS+GLP-2LPS/(μg·mL-1)01000100GLP-2/(nmol·L-1)00100100

表2 試驗2設(shè)計方案

Table 2 The design of trial 2

處理Treatment對照組ControlGLP-2組GLP-2GLP-2+Wort組GLP-2+WortGLP-2+LY組GLP-2+LYGLP-2/(nmol·L-1)0100100100Wortmanin/(nmol·L-1)00100LY294002/(μmol·L-1)00010

1.2.2 細胞常規(guī)培養(yǎng) IPEC-J2細胞進行常規(guī)細胞培養(yǎng)、傳代。細胞培養(yǎng)于T 75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(89% DMEM/F12培養(yǎng)液，5%胎牛血清，5% ITS-G，1%青鏈霉素混合液，10 ng·mL-1EGF)，隔天換液，80%融合時用0.25%的胰酶-EDTA消化液傳代。培養(yǎng)瓶二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2，95%濕度，定期觀察細胞貼壁、增殖等生長情況。取處于對數(shù)生長期的生長狀態(tài)良好的細胞進行試驗，試驗中均采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 細胞處理 取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶常規(guī)消化計數(shù)接種至6孔板上(1×105個·孔-1)，完全匯合后棄掉原培養(yǎng)液，37 ℃預(yù)熱PBS洗滌3次，含抑制劑處理組加入37 ℃預(yù)熱的只含有相應(yīng)濃度抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)液，同時其余處理組加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，而后根據(jù)試驗設(shè)計替換為37 ℃預(yù)熱試驗用培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2，95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h(激酶基因表達)或24 h(緊密連接基因表達)。

1.2.4 樣品收集 將6孔細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出后棄去培養(yǎng)液，用預(yù)熱的PBS輕輕洗滌兩次，加入Trizol(1 mL·孔-1)裂解液，仔細吹打后收集于1.5 mL無菌EP管中保存于-80 ℃用于基因相對表達量的測定。

1.2.5 考察指標及方法

1.2.5.1 各處理組IPEC-J2細胞形態(tài)觀察：使用A200型倒置相差多功能生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置，AxioVision Rel.4.6程序觀察各處理組細胞形態(tài)變化。

1.2.5.2 細胞Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的相對表達量：Akt、mTOR作為PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑的重要信號激酶，其基因表達量的變化表明該途徑的活化狀態(tài)，采用實時熒光定量PCR法測定Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1的相對表達量。(1)總RNA的提取和cDNA的合成：細胞總RNA提取按照Trizol試劑說明書進行，提取的總RNA最后溶解于DEPC處理水，使用核酸蛋白質(zhì)檢測儀測定總RNA OD260 nm/OD280 nm的值為1.8～2.0，說明提取的RNA純度較高并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 5.0 μL。反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min(去除基因組DNA反應(yīng))。上樣反應(yīng)液 10.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2 (for real-time) 4.0 μL，RNase Free dH2O→反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) →85 ℃ 5 s (反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4 ℃保存。(2)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：使用CFX-96 real-time PCR系統(tǒng)，按照SYBR?PremixExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)步驟采用兩步法進行。參照NCBI提供的目的基因序列，采用Primer5.0軟件進行引物設(shè)計，引物合成委托上海生工生物工程公司。各基因引物序列及退火溫度見表3。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1) 1.0 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1) 1.0 μL，DNA模板(<100 ng) 2.0 μL，dH2O 8.5 μL。采用兩步法并參考試劑盒說明步驟，根據(jù)Ct值最小以及熒光信號強度最大確定反應(yīng)條件。PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，各基因退火溫度30 s，循環(huán)40次；95 ℃ 10 s，隨后進行熔解曲線分析，溫度以0.5 ℃/5 s的速率從65 ℃遞增到95 ℃。采用雙△Ct +標準曲線擴增效率校正法，采用l0倍梯度稀釋法制作標準曲線，每個樣品4個重復(fù)，內(nèi)參基因為GAPDH。計算公式為相對表達量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

表3 基因擴增引物序列及退火溫度

Table 3 Gene primers sequence and annealing temperature

基因GeneGenBank登錄號AccessionNo.引物序列(5'→3')Primersequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物大小/bpSizeGAPDHNM_001206359.1Forward:GATGGTGAAGGTCGGAGTGAACReversed:TGGGTGGAATCATACTGGAACA60.9153OccludinNM_001163647.2Forward:ACGAGCAGCAAAGGGATTCTTCReversed:TCACACCCAGGATAGCACTCATT61.2152Claudin-1NM_001244539.1Forward:TGCCTCAGTGGAAGATTTACTCCReversed:TGGTGTTCAGATTCAGCAAGGA60.1147ZO-1XM_005659811.1Forward:AGTTTGATAGTGGCGTTGACACReversed:GCTGAAGGACTCACAGGAACA60.0106AktNM_001159776.1Forward:GCACAAACGAGGCGAGTAReversed:CAGCGGATGATGAAGGTGTT61.4195mTORXM_003127584.4Forward:GGATGCTGGTGTCCTTTGTGAReversed:TGCTCTGGATGGAGGTGTTCAT60.09102

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有指標均以孔為統(tǒng)計單位。采用Excel對測得的數(shù)據(jù)進行初步整理之后，用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以相對表達量“平均值±標準差”的形式表示，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平。

2 結(jié) 果

2.1 GLP-2與LPS對IPEC-J2細胞形態(tài)的影響

各處理組IPEC-J2細胞形態(tài)結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，添加100 nmol·L-1GLP-2后細胞邊界亮度增強，細胞大小形態(tài)更為勻稱，細胞密度增大，表明細胞與細胞之間的連接更為緊密；添加100 μg·mL-1LPS后部分細胞出現(xiàn)細胞膜模糊化，細胞間喪失連接失去原有形態(tài)，處理24 h后細胞萎縮脫落死亡，細胞形態(tài)與整體性受到嚴重破壞；在100 μg·mL-1LPS處理的基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2后細胞形態(tài)能夠得到有效的恢復(fù)，與100 μg·mL-1LPS組相比，細胞形態(tài)顯著改善，表明GLP-2能夠有效地抑制LPS對IPEC-J2細胞形態(tài)造成的破壞，維護細胞正常形態(tài)。

2.2 GLP-2與LPS對緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

實時熒光定量檢測的基因相對表達量結(jié)果如表4所示。與對照組相比100 nmol·L-1GLP-2處理可顯著增加IPEC-J2細胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(P<0.01)，分別比對照組增加了148%、261%和54%； 100 μg·mL-1LPS處理顯著降低了IPEC-J2細胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(P<0.01)，降低量分別為46%、57%和34%；在100 μg·mL-1LPS處理的基礎(chǔ)上添加100 nmol·L-1GLP-2能顯著地抑制由LPS造成的IPEC-J2細胞緊密連接相關(guān)蛋白mRNA表達量的下降(P<0.01)，與LPS組相比，添加100 nmol·L-1GLP-2后Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達量分別增加了46.3%、65.1%和30.3%。

圖1 GLP-2和LPS對IPEC-J2細胞形態(tài)的影響Fig.1 Effects of GLP-2 and LPS on the morphology of IPEC-J2 cells

表4 GLP-2和LPS對IPEC-J2細胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA相對表達量的影響

Table 4 Effects of GLP-2 and LPS on the mRNA relative expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells

基因Gene處理組Treatment對照組ControlLPS組LPSGLP-2組GLP-2LPS+GLP-2組LPS+GLP-2Occludin1.00±0.040.54±0.06**2.48±0.07**0.79±0.08**Claudin-11.00±0.020.43±0.04**3.61±0.08**0.71±0.10**ZO-11.00±0.030.66±0.05**1.54±0.05**0.86±0.04**

**.P<0.01.The same as Table 5

2.3 GLP-2與抑制劑對Akt、mTOR和緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

圖2和表5反映了GLP-2和兩種抑制劑對IPEC-J2細胞PI3K-Akt-mTOR途徑重要信號激酶Akt、mTOR和緊密連接蛋白 mRNA相對表達量的影響?？梢钥闯?，100 nmol·L-1GLP-2處理顯著增加了IPEC-J2細胞Akt、mTORmRNA的表達(P<0.01)，增加量分別為378%、490%；而相對應(yīng)的下游Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達也分別增加了160%、270%和59%，說明GLP-2可能激活了PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑。而添加兩種抑制劑驗證時結(jié)果表明，10 nmol·L-1Wort能夠顯著地抑制由100 nmol·L-1GLP-2處理造成的Akt以及下游mTORmRNA的增加，降低量分別為46.9%、50.5%；而Occludin、Claudin-1和

表5 阻斷劑對GLP-2處理的IPEC-J2細胞Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA相對表達量的影響

Table 5 Effects of signaling inhibitors on the relative mRNA expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells

基因Gene處理組Treatment對照組ControlGLP-2組GLP-2GLP-2+Wort組GLP-2+WortGLP-2+LY組GLP-2+LYOccludin1.00±0.042.60±0.08**1.61±0.05**1.31±0.04**Claudin-11.00±0.063.71±0.06**1.87±0.05**1.45±0.05**ZO-11.00±0.051.59±0.07**1.29±0.07**1.18±0.08**

ZO-1 mRNA的表達同樣受到抑制，降低量分別為38.1%、49.6%和18.9%。與Wort類似，添加10 μmol·L-1LY同樣能夠顯著降低100 nmol·L-1GLP-2處理造成的Akt以及下游mTORmRNA的增加，降低量分別為67.2%、70.8%，Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達也受到抑制，降低量分別為49.6%、60.9%和25.8%。

**P<0.01圖2 阻斷劑對GLP-2處理的IPEC-J2細胞Akt和mTOR mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of signaling inhibitors on the relative mRNA expression of Akt and mTOR in IPEC-J2 cells

3 討 論

3.1 LPS免疫應(yīng)激對仔豬腸上皮細胞緊密連接蛋白mRNA表達的影響

在LPS對IPEC-J2細胞上的研究表明，LPS能造成細胞炎性細胞因子大量增加，誘發(fā)細胞炎性反應(yīng)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當IPEC-J2細胞遭受LPS造成的免疫應(yīng)激時，細胞緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA表達水平顯著下降，表明LPS能造成IPEC-J2細胞緊密連接的嚴重破壞進而破壞細胞形態(tài)。Y.Hou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸上皮細胞中Claudin-1和Occludin的mRNA表達，此外還能降低空腸總RNA和總蛋白的含量。此外，Y.Liu等[19]研究結(jié)果表明，LPS能夠造成小腸形態(tài)的改變進而使小腸上皮的通透性增加，破壞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能。本研究中還發(fā)現(xiàn)，100 μg·mL-1的LPS免疫應(yīng)激并不能完全破壞IPEC-J2細胞的整體結(jié)構(gòu)和緊密連接關(guān)鍵蛋白mRNA的表達。該結(jié)果與M.M.Geens等[20]和C.Arce等[21]的研究結(jié)果一致，說明IPEC-J2細胞對LPS免疫應(yīng)激具有一定的抵抗能力，在遭遇LPS免疫應(yīng)激后能避免細胞結(jié)構(gòu)和功能被徹底破壞。

3.2 GLP-2對應(yīng)激仔豬腸上皮緊密連接蛋白基因表達的保護效應(yīng)

C.X.Dong等[22]報道，GLP-2能夠顯著提高小鼠空腸緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin和Claudin-3，7基因的表達。G.W.Moran等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-2不僅能夠顯著增加Caco-2細胞緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin和ZO-1的表達，還能有效抑制由TNFα應(yīng)激造成的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達量的降低。以上結(jié)果表明，GLP-2能夠有效地促進腸上皮細胞緊密連接的表達，增強腸道屏障功能。在以IPEC-J2細胞為研究模型研究GLP-2之前，必須明確的是IPEC-J2細胞是否存在GLP-2R表達，本研究前期試驗證明了該細胞存在GLP-2R的表達，GLP-2可能對IPEC-J2細胞產(chǎn)生作用。本試驗在仔豬空腸細胞模型上的研究結(jié)果表明，GLP-2能夠顯著地改善正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的表達。此外，GLP-2還能有效的抑制LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細胞形態(tài)的破壞和緊密連接關(guān)鍵蛋白基因表達量的下降。該結(jié)果提示，GLP-2能促進健康仔豬腸道上皮細胞緊密連接基因的表達，有效的抑制LPS造成的免疫應(yīng)激，維護上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，能作為未來緩解仔豬斷奶應(yīng)激的一種理想營養(yǎng)手段。

3.3 GLP-2通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)上皮細胞緊密連接

C.I.Cheeseman[24]研究表明，GLP-2能夠通過增加小鼠空腸刷狀緣膜鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的含量從而促進空腸的生長發(fā)育，進一步使用PI3K特異性抑制劑Wortmannin研究表明GLP-2的促蛋白表達和促細胞生長的作用效應(yīng)可能通過了PI3K。B.Yusta等[25]研究表明，GLP-2能夠通過PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)到途徑促進幼倉鼠腎上皮細胞的生長抑制細胞的凋亡。X.Shi等[26]研究表明，GLP-2能夠通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑促進上皮細胞蛋白質(zhì)的合成，從而確定了mTOR在GLP-2促進細胞蛋白質(zhì)表達中的重要地位。

然而，J.A.Koehler等[27]研究報道，GLP-2并沒有通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控小鼠或人結(jié)腸癌細胞的生長和存活。該研究提示我們，不是在所有的細胞或組織中GLP-2都能通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控細胞的生長，細胞內(nèi)蛋白的表達。因此，明確PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑在GLP-2調(diào)控仔豬空腸上皮細胞緊密連接基因表達中的作用具有重要的研究意義。本試驗的研究結(jié)果表明，GLP-2能夠顯著的增加PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑重要激酶Akt和mTOR基因的表達，其作用不僅增加了相應(yīng)該信號分子蛋白的表達，更重要的是增加了信號分子蛋白被磷酸化的可能，下游緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因的表達量也相應(yīng)提高。在進行細胞信號轉(zhuǎn)導途徑研究時，在細胞正常狀態(tài)下、在關(guān)鍵位點使用兩種抑制劑或激活劑能更準確檢測出該信號轉(zhuǎn)導途徑是否參與信號物質(zhì)的傳導[28]。本研究使用PI3K特異性抑制劑Wortmannin和LY294002阻斷PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑后Akt和mTOR基因表達量顯著下降，而下游緊密連接關(guān)鍵蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的基因表達量的提高量顯著下降。本試驗結(jié)果與X.Shi等[29]的研究結(jié)果一致，提示我們PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑是GLP-2調(diào)節(jié)細胞緊密連接基因表達的重要信號途徑之一。

4 結(jié) 論

GLP-2能夠提高正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2細胞緊密連接基因的表達量、改善細胞形態(tài)，而且能夠有效抑制LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細胞緊密連接基因的表達量的降低和細胞形態(tài)的破壞，從而提高IPEC-J2細胞抵抗LPS應(yīng)激的能力；GLP-2能通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控IPEC-J2細胞緊密連接基因的表達，PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑可能是GLP-2調(diào)控仔豬空腸上皮細胞緊密連接基因表達的重要途徑之一。

[1] NIEKAMP S R，SUTHERLAND M A，DAHL G E，et al.Immune responses of piglets to weaning stress：Impacts of photoperiod[J].JAnimSci，2007，85(1)：93-100.

[2] SMITH F，CLARK J E，OVERMAN B L，et al.Early weaning stress impairs development of mucosal barrier function in the porcine intestine[J].AmJPhysiol-GastrL，2010，298(3)：G352-G363.

[3] ZHAO Y，QIN G，SUN Z，et al.Effects of soybean agglutinin on intestinal barrier permeability and tight junction protein expression in weaned piglets[J].IntJMolSci，2011，12(12)：8502-8512.

[4] 劉海萍，胡彩虹，徐 勇.早期斷奶對仔豬腸通透性和腸上皮緊密連接蛋白 Occludin mRNA 表達的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2008，20(4)：442-446. LIU H P，HU C H，XU Y.Effects of early weaning on intestinal permeability and tight junction protein occludin mRNA expression levels of piglets[J].ChineseJournalofAnimalNutrition，2008，20(4)：442-446.(in Chinese)

[5] SIGALET D L，DE HEUVEL E，WALLACE L，et al.Effects of chronic glucagon-like peptide-2 therapy during weaning in neonatal pigs[J].RegulPeptides，2014，188：70-80.

[6] NAIMI R M，MADSEN K B，ASKOV-HANSEN C，et al.A dose-equivalent comparison of the effects of continuous subcutaneous glucagon-like peptide 2 (GLP-2) infusions versus meal related GLP-2 injections in the treatment of short bowel syndrome (SBS) patients[J].RegulPeptides，2013，184：47-53.

[7] SHI X，WEN S，CHANG B，et al.GLP-2 receptor is required for glucose homeostasis and energy balance[J].FASEBJ，2013，27：1160.

[8] PETERSEN Y M，HARTMANN B，HOLST J J，et al.Introduction of enteral food increases plasma GLP-2 and decreases GLP-2 receptor mRNA abundance during pig development[J].JNutr，2003，133(6)：1781-1786.

[9] BURRIN D G，PETERSEN Y，STOLL B，et al.Glucagon-like peptide 2：a nutrient-responsive gut growth factor[J].JNutr，2001，131(3)：709-712.

[10] BENJAMIN M A，MCKAY D M，YANG P C，et al.Glucagon-like peptide-2 enhances intestinal epithelial barrier function of both transcellular and paracellular pathways in the mouse[J].Gut，2000，47(1)：112-119.[11] CAMERON H L，PERDUE M H.Stress impairs murine intestinal barrier function：improvement by glucagon-like peptide-2[J].JPharmacolExpTher，2005，314(1)：214-220.

[12] DONG C X.Mechanisms of glucagon-like peptide-2-mediated effects on intestinal barrier function in health and irinotecan-induced enteritis[D].Toronto，Ontario，Canada：University of Toronto，2013.

[13] GU M J，SONG S K，PARK S M，et al.Bacillus subtilis protects porcine intestinal barrier from deoxynivalenol via improved zonula occludens-1 expression[J].Asian-AustJAnimSci，2014，27(4)：580-586.

[14] KOEHLER J A，HARPER W，BARNARD M，et al.Glucagon-like peptide-2 does not modify the growth or survival of murine or human intestinal tumor cells[J].CancerRes，2008，68(19)：7897-7904.

[15] JIANG Z Y，SUN L H，LIN Y C，et al.Effects of dietary glycyl-glutamine on growth performance，small intestinal integrity，and immune responses of weaning piglets challenged with lipopolysaccharide[J].JAnimSci，2009，87(12)：4050-4056.

[16] PASZTI-GERE E，MATIS G，F(xiàn)ARKAS O，et al.The effects of intestinal LPS exposure on inflammatory responses in a porcine enterohepatic co-culture system[J].Inflammation，2014，37(1)：247-260.

[17] RAZZUOLI E，VILLA R，AMADORI M.IPEC-J2 cells as reporter system of the anti-inflammatory control actions of interferon-alpha[J].JInterfCytokRes，2013，33(10)：597-605.

[18] HOU Y，WANG L，ZHANG W，et al.Protective effects of N-acetylcysteine on intestinal functions of piglets challenged with lipopolysaccharide[J].AminoAcids，2012，43(3)：1233-1242.

[19] LIU Y，HUANG J，HOU Y，et al.Dietary arginine supplementation alleviates intestinal mucosal disruption induced byEscherichiacolilipopolysaccharide in weaned pigs[J].BritJNutr，2008，100(3)：552-560.[20] GEENS M M，NIEWOLD T A.Preliminary characterization of the transcriptional response of the porcine intestinal cell line IPEC-J2 to enterotoxigenicEscherichiacoli，Escherichiacoli，andE.colilipopolysaccharide[J].CompFunctGenomics，2010，2010：469583.

[21] ARCE C，RAMIREZ-BOO M，LUCENA C，et al.Innate immune activation of swine intestinal epithelial cell lines (IPEC-J2 and IPI-2I) in response to LPS fromSalmonellatyphimurium[J].CompImmunolMicrob，2010，33(2)：161-174.

[22] DONG C X，ZHAO W，SOLOMON C，et al.The intestinal epithelial insulin-like growth factor-1 receptor links glucagon-like peptide-2 action to gut barrier function[J].Endocrinology，2013，155(2)：370-379.

[23] MORAN G W，O′NEILL C，MCLAUGHLIN J T.GLP-2 enhances barrier formation and attenuates TNFα-induced changes in a Caco-2 cell model of the intestinal barrier[J].RegulPeptides，2012，178(1)：95-101.

[24] CHEESEMAN C I.Upregulation of SGLT-1 transport activity in rat jejunum induced by GLP-2 infusioninvivo[J].AmJPhysiol-RegI，1997，273(6)：R1965-R1971.

[25] YUSTA B，ESTALL J，DRUCKER D J.Glucagon-like peptide-2 receptor activation engages bad and glycogen synthase kinase-3 in a protein kinase A-dependent manner and prevents apoptosis following inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase[J].JBiolChem，2002，277(28)：24896-24906.

[26] SHI X，LI X，WANG Y，et al.Glucagon-like peptide-2-stimulated protein synthesis through the PI 3-kinase-dependent Akt-mTOR signaling pathway[J].AmnJPhysiol-EndocM，2011，300(3)：E554-E563.

[27] KOEHLER J A，HARPER W，BARNARD M，et al.Glucagon-like peptide-2 does not modify the growth or survival of murine or human intestinal tumor cells[J].CancerRes，2008，68(19)：7897-7904.

[28] NAN L，JOSEF N.Glutamine deprivation alters intestinal tight junctions via a PI3-K/Akt mediated pathway in Caco-2 cells[J].JNutr，2009，139(4)：710-714.[29] SHI X，ZHOU F，LI X，et al.Central GLP-2 enhances hepatic insulin sensitivity via activating PI3K signaling in POMC neurons[J].CellMetab，2013，18(1)：86-98.

(編輯 郭云雁)

The Effects of GLP-2 on Cell Morphology and the Gene Expression of Tight Junction in LPS Stressed IPEC-J2 Cells

YU Chang-song，JIA Gang*，DENG Qiu-hong，CHEN Xiao-ling，ZHAO Hua，LIU Guang-mang，WANG Kang-ning

(KeyLaboratoryofAnimalDisease-resistantNutritionandFeedofMinistryofAgriculture，AnimalNutritionInstitute，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

The purpose of this research was to investigate the effect of glucagon-like peptide-2(GLP-2) and lipopolysaccharide (LPS) on the gene expression of tight junction in piglets jejunum epithelial IPEC-J2 cells and to deeply discuss the possible mechanism of GLP-2 regulating the expression of intestinal TJ gene of the piglet.Trial 1，single factor design was adopted and 4 treatments(control，GLP-2，LPS，LPS+GLP-2) were used to test the effect of GLP-2 and LPS on the mRNA expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 in IPEC-J2 cells.The results showed that：100 nmol·L-1GLP-2 could improve cellular morphology and significantly increase the expression level ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cell (P<0.01)；100 μg·mL-1LPS could significantly destroy cellular morphology and significantly reduce the mRNA expression of TJ in IPEC-J2 cells (P<0.01).LPS with 100 nmol·L-1GLP-2 could improve cellular morphology and significantly increase the expression ofOccludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cell (P<0.01) for 46.3%，65.1% and 30.3%，respectively.Trial 2，PI3K specific inhibitor，Wortmannin (Wort) and LY294002 (LY)，were added to investigate whether GLP-2 modulates TJ’s mRNA expression in IPEC-J2 cells through PI3K-Akt-mTOR signal transduction pathway.Four treatments(control，GLP-2，GLP-2+Wort，GLP-2+LY) were designed.The results showed that：100 nmol·L-1GLP-2 with 10 nmol·L-1Wort could significantly decrease the expression ofAkt，mTOR，Occludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cells (P<0.01) for 46.9%，50.5%，38.1%，49.6% and 18.9%，respectively；GLP-2 with LY could significantly decrease the expression ofAkt，mTOR，Occludin，Claudin-1 andZO-1 mRNA in IPEC-J2 cells (P<0.01) for 67.2%，70.8%，49.6%，60.9% and 25.8%，respectively.In summary，the results showed that GLP-2 can effectively inhibit the damnification of TJ mRNA expression by LPS.GLP-2 may modulate TJ’s mRNA expression through PI3K-Akt-mTOR signal transduction pathway in IPEC-J2 cells.

glucagon-like peptide-2；lipopolysaccharide；piglet intestinal epithelial cell jejunum 2；tight junctions；PI3K-Akt-mTOR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.012

2014-06-20

四川省杰出青年基金(2010JQ0043)；教育部博士點基金(2015103110011)

余長松(1988-)，男，四川樂山人，碩士，主要從事飼料資源開發(fā)與高效利用研究，E-mail:yuchangsong0327@163.com

*通信作者：賈 剛，教授，博士生導師，E-mail：jiagang700510@163.com

S828；S815

A

0366-6964(2015)04-0592-08