程 蕾，王定發(fā)，劉曉華，向 敏，凌明湖，胡修忠，夏 瑜

(武漢市農(nóng)業(yè)科學技術(shù)研究院畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208)

ISG15和OAS1在奶牛早期妊娠階段外周血中的表達規(guī)律

程 蕾*，王定發(fā)，劉曉華，向 敏，凌明湖，胡修忠，夏 瑜

(武漢市農(nóng)業(yè)科學技術(shù)研究院畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208)

本研究旨在揭示干擾素刺激基因ISG15和OAS1在中國荷斯坦奶牛早期妊娠階段外周血中的表達規(guī)律，為利用干擾素刺激基因進行早期妊娠診斷提供理論和方法上的指導(dǎo)。試驗用青年母牛共27頭，其中自然發(fā)情牛10頭，同期發(fā)情牛17頭；人工授精后0、14、18、21和28 d采集外周血并分離總白細胞或白細胞亞類(淋巴細胞、單核細胞、NK細胞)；采用熒光定量PCR檢測ISG15和OAS1的相對表達量。結(jié)果表明：人工授精后18 d妊娠牛外周血中ISG15和OAS1的相對表達量均顯著高于空懷牛；ISG15在妊娠牛中一致上調(diào)(平均3.92倍)，空懷牛中一致下調(diào)(平均1.46倍)；OAS1在妊娠牛中平均上調(diào)3.49倍，空懷牛平均下調(diào)1.28倍。自然發(fā)情條件下，妊娠牛外周血中ISG15和OAS1的相對表達量均顯著高于空懷牛，同期發(fā)情條件下兩個基因在表達趨勢上與之類似，但差異不顯著；進一步分析顯示：人工授精后18 dOAS1在妊娠牛淋巴細胞中的表達顯著高于空懷牛，其中妊娠牛中OAS1一致上調(diào)表達，平均上調(diào)2.14倍，空懷牛中OAS1一致下調(diào)，平均下調(diào)1.80倍。研究提示：人工授精后第18 天妊娠牛與空懷牛之間ISG15的差異表達比OAS1更明顯；自然發(fā)情狀態(tài)下，妊娠牛與空懷牛之間兩個基因差異表達情況比同期發(fā)情狀態(tài)下更明顯；相對于外周血總白細胞，妊娠牛與空懷牛外周血淋巴細胞中ISG15、OAS1的差異表達倍數(shù)更低。綜上表明，利用外周血中ISG15的表達水平可望能夠在人工授精后18 d對自然發(fā)情奶牛較為準確地做出早期妊娠診斷；對于ISG15、OAS1在外周血免疫細胞亞類中的表達分析，為深入研究奶牛早期妊娠識別的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

奶牛；ISG15；OAS1；妊娠診斷；基因表達

妊娠診斷是奶牛生產(chǎn)管理中的重要環(huán)節(jié)，通過判斷奶牛的妊娠與否，可及時對空懷牛采取措施進行復(fù)配，以盡可能地提高繁殖效率。血清/牛奶中孕酮或妊娠相關(guān)蛋白的檢測以及直腸檢查是目前較常見的妊娠診斷方法，但是這些手段均是在奶牛人工授精3周后才能進行準確診斷[1-4]。如果奶牛人工授精不成功或者發(fā)生早期胚胎損失，在3周左右會返情，但是有些空懷牛的返情日期可能會延遲。如果在人工授精后3周能排查空懷牛，可對其實施快速同期發(fā)情，在第21～23天進行復(fù)配，減少空懷天數(shù)和提高奶牛的繁殖率，同時可以減少空懷導(dǎo)致的經(jīng)濟損失，進而提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益[5]。目前，能否于奶牛人工授精后一個情期內(nèi)做出判斷的早期妊娠診斷技術(shù)已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點之一。

干擾素-τ(IFN-τ)是反芻動物妊娠識別的關(guān)鍵信號[6]。它作為一種旁分泌因子，可以與子宮內(nèi)膜細胞的相關(guān)受體結(jié)合，下調(diào)催產(chǎn)素受體表達，破壞PGF2α脈沖釋放，使得黃體不被溶解，進而維持孕酮分泌以維持妊娠。孕體發(fā)育到囊胚期，滋養(yǎng)外胚層開始分泌IFN-τ，隨著囊胚的延伸，分泌量也不斷增加，孕體附著于子宮上皮即著床之前IFN-τ含量達到峰值，著床之后其分泌量減退。IFN-τ并不是僅在子宮中分泌，它可以分泌到子宮腔，進入子宮靜脈，由于該細胞因子含量極低，目前尚不能通過對其直接檢測進行妊娠診斷[7-8]。但IFN-τ可引起外周血細胞中干擾素刺激基因的上調(diào)表達[7，9]，這些干擾素刺激基因的上調(diào)表達一方面有助于促進妊娠建立[9]，另一方面為建立新的早期妊娠診斷方法提供了契機。

干擾素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15，ISG15)和2′-5′寡腺苷酸合成酶1(2′-5′-oligoadenylate Synthetase 1，OAS1)基因是目前研究比較集中的兩個重要干擾素刺激基因，已被證實與妊娠相關(guān)[8，10-11]。但是，利用干擾素刺激基因的表達量進行妊娠診斷受諸多因素的影響，例如奶牛品種、胎次、檢測和分析方法等，它們均可能影響到妊娠診斷的準確性，截至目前，相關(guān)技術(shù)在國內(nèi)外仍處于研究階段?；诖?，本研究以中國荷斯坦奶牛為試驗牛群，分別于人工授精后14、18、21和28 d采集奶牛外周血，用熒光定量PCR方法檢測了ISG15和OAS1基因在不同發(fā)情誘因奶牛外周血中表達變化規(guī)律；通過分離人工授精后18和21 d奶牛外周血中的淋巴細胞、NK細胞和單核細胞，進一步檢測了ISG15和OAS1基因在不同白細胞亞類中的表達量。本研究為深入揭示ISG15和OAS1基因的表達規(guī)律和利用基因轉(zhuǎn)錄水平建立科學的早期妊娠診斷方法提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣本采集

選擇武漢市惠爾康揚子江乳業(yè)有限公司和金旭畜牧科技發(fā)展有限公司奶牛場體況一致的青年牛，10頭自然發(fā)情的奶牛按照奶牛場的正常程序進行人工授精，9頭達到配種條件但尚未發(fā)情的青年牛采用生源2+1(寧波三生藥業(yè)有限公司)實施同期發(fā)情和定時輸精程序：即先注射1支生源(注射用促性腺激素釋放激素GnRH，100 μg·支-1)，7 d后注射1支誘情素(注射用氯前列醇鈉PG-Cl，0.5 mg·支-1)，接著48 h之后再注射1支生源，16～18 h后不用觀察母牛的發(fā)情表現(xiàn)直接輸精。利用EDTAK2自動定量靜脈采血管(武漢致遠醫(yī)療科技有限公司)分別于人工授精后0、14、18、21和28 d尾靜脈采集血液5～10 mL(n=19)，2 h內(nèi)冷藏運輸至實驗室后立即進行總RNA提取。人工授精后50～60 d進行直腸檢查，根據(jù)直腸檢查的結(jié)果將試驗牛只分為妊娠牛和空懷牛。其中，自然發(fā)情妊娠牛5頭，空懷牛5頭；同期發(fā)情妊娠牛6頭，空懷牛3頭。

對同期發(fā)情青年牛(n=8)分別于人工授精后0、18和21 d采集外周血，樣本2 h內(nèi)冷藏運輸至實驗室后分別進行白細胞亞類分離和細胞總RNA提取。根據(jù)直腸檢查結(jié)果將試驗牛只分為妊娠牛(n=4)和空懷牛(n=4)。

1.2 白細胞亞類分離、總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用單核細胞、淋巴細胞和NK細胞分離試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)分離外周血中白細胞亞類。利用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒或RNAprep pure培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)分別提取全血和白細胞亞類中總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書進行。利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific)計算RNA樣本濃度并進行純度分析(OD260 nm/OD280 nm=1.9～2.1)；利用改良的常規(guī)瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳檢測RNA完整性[12]；通過質(zhì)檢的樣本分裝后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄采用RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit(Fermentas)進行，每個反應(yīng)RNA用量為500 ng，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 牛ISG15和OAS1基因的熒光定量PCR檢測

用于熒光定量PCR擴增的預(yù)混液(SYBR?Green Mix)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR?Green 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板0.3 μL，最后用ddH2O補至20 μL。牛ISG15、OAS1及內(nèi)參基因β-Actin引物信息見表1[8，10]。每個樣本重復(fù)3次，定量PCR試驗在羅氏LightCycler?480實時熒光PCR儀上進行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，60～62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線及信號采集：58～95 ℃，0.5 ℃·s-1，共10 s。

表1 定量PCR引物的序列及參數(shù)

Table 1 Primer sequences and parameters used for the real-time quantitative PCR

目的基因Targetgenes引物序列(5'-3')Primersequences退火溫度/℃Tm擴增長度/bpProductsizeISG15F:GGTATCCGAGCTGAAGCAGTTR:ACCTCCCTGCTGTCAAGGT6287OAS1F:ACCCTCTCCAGGAATCCAGTR:GATTCTGGTCCCAGGTCTGA60199β-ActinF:CTGGACTTCGAGCAGGAGATR:GGATGTCGACGTCACACTTC60/62208

1.4 數(shù)據(jù)分折

基因相對表達以2-△△Ct表示樣品中目的基因mRNA相對表達量[13]，0 d 時各基因的相對表達量較正為1，其他時間點的表達量均為0 d 時表達量的倍數(shù)。試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤(X±SEM)”表示，妊娠牛與空懷牛各時間點基因表達量的差異采用t檢驗。P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié) 果

2.1ISG15和OAS1基因在奶牛外周血液中的表達

人工授精后一個情期內(nèi)，干擾素刺激基因ISG15和OAS1在妊娠牛外周血液中的表達量發(fā)生顯著變化(圖1)；二者整體上呈上升趨勢并于21 d 達到峰值，28 d 時輕微下調(diào)或保持不變。空懷牛ISG15和OAS1基因的表達量在14和18 d 無明顯變化，而21和28 d上調(diào)表達且幅度較大。人工授精后14、21和28 d，妊娠牛ISG15、OAS1基因的表達量與空懷牛均無顯著差異；而人工授精后18 d，妊娠牛外周血液中ISG15基因的表達量極顯著高于空懷牛(P<0.01)，妊娠牛OAS1基因的表達量顯著高于空懷牛(P<0.05)。人工授精后第18天，妊娠牛中ISG15基因一致上調(diào)表達，平均上調(diào)表達3.92倍，空懷牛中ISG15基因一致下調(diào)表達，平均下調(diào)表達1.46倍(表2)。與ISG15基因相比，盡管第18天妊娠?；蚩諔雅Ｄ承﹤€體中OAS1基因的表達趨勢不同，但總體上妊娠牛中OAS1基因平均上調(diào)表達3.49倍，空懷牛平均下調(diào)表達1.28倍(表2)。

**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(P<0.05)，下同**.Significance level of 0.01；*.Significance level of 0.05；The same as below圖1 ISG15和OAS1在奶牛外周血液中的相對表達量Fig.1 Relative gene expressions of bovine ISG15 and OAS1 in peripheral blood

表2 人工授精后18 d妊娠牛和空懷牛中ISG15、OAS1相對于0 d(對照)的表達量

Table 2 The comparative gene expressions(18 dvs.0 d) ofISG15 andOAS1 on 18 d post artificial insemination

試驗牛DairycowsISG15基因表達(18dvs.0d)ComparativegeneexpressionsofISG15(18dvs.0d)OAS1基因表達(18dvs.0d)ComparativegeneexpressionsofOAS1(18dvs.0d)妊娠牛Pregnantdairycows100480a6.086.88100482a8.516.62100253a1.151.83100547a2.680.69100128a1.549.96100429b8.2441.841072b4.002.101073b1.000.731074b2.762.508034b2.920.788014b4.292.83空懷牛non-pregnantdairycows100517a0.310.14110001a0.641.13100511a0.860.64100567a0.800.92100334a0.381.23100434b0.810.709067b1.000.798019b0.700.69

a.自然發(fā)情；b.同期發(fā)情

a.Dairy cows of spontaneous estrus；b.Dairy cows of oestrus synchronisation

2.2 不同發(fā)情誘因下ISG15和OAS1基因在奶牛外周血中的表達

在不同的發(fā)情誘因下，人工授精后外周血中干擾素刺激基因ISG15和OAS1的表達量變化不同(圖2)?？傮w上，人工授精后一個情期內(nèi)，自然發(fā)情妊娠牛和同期發(fā)情妊娠牛ISG15和OAS1基因的表達趨勢一致，均表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)并于21 d達到峰值。自然發(fā)情空懷牛與同期發(fā)情空懷牛在人工授精后14和18 d表達趨勢一致，且變化幅度較?。?1和28 d表達趨勢相反，其中，自然發(fā)情的空懷牛在21和28 d呈上調(diào)表達，而同期發(fā)情的空懷牛無明顯變化。人工授精后第18天，自然發(fā)情妊娠牛外周血中ISG15的表達量顯著高于空懷牛(P<0.05)，其中，妊娠牛中ISG15基因平均上調(diào)3.99倍，空懷牛中ISG15基因平均下調(diào)1.68倍；對應(yīng)的，同期發(fā)情奶牛在人工授精后第18天， 妊娠牛中ISG15基因平均上調(diào)3.87倍，空懷牛平均下調(diào)1.20倍，分析顯示P值(P=0.076)與0.05接近，但仍不具備統(tǒng)計學上的顯著性差異。OAS1基因在不同發(fā)情誘因下的表達變化和ISG15基因相似：人工授精后18 d，自然發(fā)情妊娠牛中OAS1基因的表達量顯著高于空懷牛(P<0.05)，而同期發(fā)情妊娠牛與空懷牛間外周血中其表達變化無顯著性差異。人工授精后21 d，在兩種不同發(fā)情誘因下，妊娠牛與空懷牛ISG15和OAS1基因的表達量雖然在統(tǒng)計學上差異沒有達到顯著水平，但是P值均與0.05相差不大(P值分別為0.098和0.090)。人工授精后14和28 d，妊娠牛與空懷牛ISG15和OAS1基因的表達量均差異不顯著。

圖2 不同發(fā)情誘因下ISG15和OAS1在奶牛外周血中的相對表達量Fig.2 Relative gene expressions of bovine ISG15 and OAS1 in peripheral blood at different estrus conditions

2.3ISG15和OAS1基因在奶牛外周血不同白細胞亞類中的表達

分析結(jié)果顯示，人工授精后18和21 d，妊娠牛與空懷牛外周血淋巴細胞、NK細胞和單核細胞中ISG15基因的相對表達量差異不顯著；而妊娠牛與空懷牛外周血液淋巴細胞中OAS1基因的相對表達量呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)(圖3)。趨勢上，人工授精后18和21 d妊娠牛外周血淋巴細胞、NK細胞和單核細胞中ISG15和OAS1基因呈持續(xù)上調(diào)表達；而空懷牛中ISG15和OAS1基因的相對表達量無明顯的變化。其中，第18天妊娠牛外周血淋巴細胞中OAS1基因一致上調(diào)，平均上調(diào)2.14倍，空懷牛中一致下調(diào)，平均下調(diào)1.8倍；妊娠牛外周血淋巴細胞中ISG15基因平均上調(diào)3.39倍，空懷牛中平均上調(diào)1.20倍，但二者ISG15基因的表達量差異不顯著。

圖3 ISG15和OAS1在奶牛外周血白細胞亞類中的相對表達變化Fig.3 Relative gene expressions of bovine ISG15 and OAS1 in subpopulations of peripheral blood leukocytes

3 討 論

外周血白細胞已被有效應(yīng)用于挖掘人以及奶牛等動物特殊生理條件下的生物標志物研究，機體由于感染和/或激素內(nèi)分泌，相關(guān)炎癥和細胞因子等因素會導(dǎo)致體液物質(zhì)發(fā)生改變，進而引起基因表達模式發(fā)生廣泛、快速和復(fù)雜的變化[14-15]。因此，外周血白細胞的基因表達模式為發(fā)掘引起生理顯著變化的生物標志物提供了有效手段[16]。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了中國荷斯坦奶牛妊娠早期階段干擾素刺激基因ISG15和OAS1在外周血白細胞中的表達規(guī)律，結(jié)果表明：人工授精后18 d，妊娠牛外周血中ISG15和OAS1基因的相對表達量均顯著高于空懷牛，與前人的研究結(jié)果基本一致[8，10-11]。據(jù) J.C.Green等[8]報道，人工授精后18 d 奶牛外周血白細胞中OAS1基因上調(diào)表達1.4倍以上的均為妊娠牛，利用此方法進行妊娠診斷的準確性達100%。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然奶牛外周血白細胞中OAS1基因表達上調(diào)1.4倍以上的均為妊娠牛(人工授精后18 d)，但部分妊娠牛只上調(diào)倍數(shù)低于1.4倍甚至下調(diào)表達，說明不同品種間存在一定的差異，并暗示在診斷中利用該基因的表達變化仍存在假陰性判斷風險，實際生產(chǎn)管理中可能會造成很大的不必要損失。本研究揭示妊娠牛中ISG15基因一致上調(diào)，空懷牛個體ISG15基因一致下調(diào)，表明：ISG15基因的相對表達量在妊娠牛與空懷牛之間的臨界點較OAS1基因更加明顯。這為人們有針對性地在中國荷斯坦牛群中進行早期妊娠診斷提供了有價值的參考，但由于本試驗樣本的限制，通過外周血利用ISG15基因在人工授精后18天進行妊娠診斷的可靠性還需要進一步驗證。

同期發(fā)情技術(shù)主要是通過利用外源激素處理，人為控制并調(diào)整奶牛在預(yù)定時間內(nèi)的集中發(fā)情、排卵并施以配種、管理，據(jù)此可提高牛群的繁殖效率，因而被廣泛應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)。但是，由于藥物以及勞動成本的限制，該技術(shù)僅在特定的情況下，例如胚胎移植和奶牛乏情的狀態(tài)下采用，實際生產(chǎn)中國內(nèi)大部分奶牛場還是在自然發(fā)情的條件下實施人工授精。本研究通過進一步分析不同發(fā)情誘因條件下基因的表達變化揭示了一個比較有意思的現(xiàn)象：人工授精后18 d自然發(fā)情妊娠牛中ISG15和OAS1在外周血白細胞中的表達量均顯著高于自然發(fā)情的空懷牛；同期發(fā)情狀態(tài)下的妊娠牛與空懷牛外周血白細胞中ISG15和OAS1基因的表達量與自然發(fā)情狀態(tài)下的表達趨勢類似，盡管分析顯示P值與0.05接近，但仍不具備統(tǒng)計學上的顯著性差異。這可能與本試驗中同期發(fā)情空懷牛頭數(shù)較少并且動物個體間差異較大有關(guān)，具體機制如遺傳、營養(yǎng)、個體狀態(tài)(疾病)等尚有待深入研究；也可能與所采用的同期發(fā)情處理方法有關(guān)。已有研究表明，采用不同的同期發(fā)情處理方法，由于發(fā)情藥物的種類、劑量和處理時間不同，會對排卵和妊娠率產(chǎn)生不同影響[17-18]。即使采用同樣的同期發(fā)情處理方法和藥物，對不同的品種或者品系也會產(chǎn)生不同的效果，因此，盡管試驗牛在配種前都有明顯的發(fā)情表現(xiàn)，而且血清中孕酮的含量都低于1 ng·mL-1，但是不同同期發(fā)情方法處理后胚胎生長發(fā)育可能存在差異，而胚胎的大小直接影響IFN-τ的分泌量[8]。據(jù)此，這也可能是本試驗中干擾素刺激基因的表達變化與之前的相關(guān)報道略微存在差異的原因[8，10-11]，但在某些情況下如果生硬套用國外的診斷標準，1倍以內(nèi)的差別就有可能致使誤判風險大大增加。

外周血白細胞由不同的細胞亞類組成，包括顆粒細胞、淋巴細胞，單核細胞等。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素刺激基因在這些不同細胞亞類中的表達量存在差異[11]。奶牛妊娠識別階段，外周血白細胞參與的先天免疫應(yīng)答被激活，尤其是NK細胞、γδT細胞和調(diào)節(jié)性T細胞被募集至子宮內(nèi)膜，促進母體免疫系統(tǒng)識別和接納孕體[19]。NK細胞的數(shù)量與分布在早期妊娠階段發(fā)生了顯著的變化[20]。為了深入分析ISG15、OAS1在這些關(guān)鍵細胞亞類中的表達變化，本研究在前階段分析基礎(chǔ)之上進一步分離了人工授精后18和21 d外周血中的淋巴細胞、單核細胞和NK細胞。結(jié)果表明，妊娠牛淋巴細胞中OAS1基因在人工授精后18 d的相對表達量顯著高于空懷牛，但是在單核細胞和NK細胞中無顯著差異。IFN-τ信號通過JAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活通路(STAT1)發(fā)揮作用[21]，STAT1磷酸化是I型干擾素(包括IFN-τ)刺激引起的細胞信號應(yīng)答的關(guān)鍵步驟，I型干擾素刺激后淋巴細胞的磷酸化程度顯著上升[22]，這也可能是導(dǎo)致淋巴細胞中OAS1基因相對表達量差異顯著的原因，為進一步揭示OAS1基因于早期妊娠識別階段的作用機制指明了方向。

人工授精后18 d，盡管妊娠牛外周血淋巴細胞中OAS1相對于空懷牛的表達量呈顯著差異，但是差異程度(倍數(shù))不如在總白細胞中明顯，而從妊娠診斷方法學上來看，細胞亞類的分離無疑增加了妊娠診斷的繁瑣程度。K.Kizaki等[23]通過對妊娠牛外周血白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞檢測后發(fā)現(xiàn)，人工授精后14 dISG15和OAS1基因在中性粒細胞中的表達量顯著高于其它亞類，提示：中性粒細胞可能對包括IFN-τ在內(nèi)的妊娠識別信號反應(yīng)比較敏感；但同時該研究表明，人工授精后14 d空懷牛外周血中性粒細胞中ISG15和OAS1基因也呈上調(diào)表達趨勢，因此，授精后14 d利用這兩個基因在中性粒細胞中的表達進行妊娠診斷的準確性尚存在很大疑問；同時細胞分離步驟會增加檢測的繁瑣程度，可能會對干擾素刺激基因表達量檢測的準確性造成影響，增加誤判機率。針對這一問題，本研究結(jié)果提示，ISG15基因在外周血中(總白細胞中)的表達水平可望能夠?qū)ψ匀话l(fā)情的奶牛較為準確地做出診斷，即人工授精后18 d，上調(diào)1倍(相對于0 d)以上為妊娠牛，下調(diào)為空懷牛。下一步需要擴大群體樣本規(guī)模進一步驗證，并通過優(yōu)化基因表達閾值來提高判斷的準確性。多個干擾素刺激基因(目前發(fā)現(xiàn)至少有ISG15和OAS1)可能在不同的免疫細胞中通過相同或不同的機制共同影響母體妊娠識別(母體-孕體互作)。暫且不考慮其中復(fù)雜的分子信號，單從方法學上講：也可以綜合利用多基因，通過特異性基因擴增引物設(shè)計實現(xiàn)ISG15和OAS1在定量PCR中的雙通道同時檢測來增加奶牛早期妊娠診斷的可靠性和準確性。

4 結(jié) 論

中國荷斯坦奶牛人工授精后18 d，妊娠牛外周血中ISG15、OAS1基因的相對表達量均顯著高于空懷牛，但ISG15基因的表達量在妊娠牛與空懷牛之間的差異更明顯；自然發(fā)情狀態(tài)下，妊娠牛與空懷牛外周血白細胞ISG15、OAS1基因的差異表達程度比同期發(fā)情狀態(tài)下明顯；利用ISG15基因在外周血中(總白細胞中)的表達水平可望能夠?qū)ψ匀话l(fā)情奶牛做出較為準確的妊娠診斷，但在此基礎(chǔ)上的相關(guān)判別標準還可以進一步優(yōu)化；另外，ISG15和OAS1基因在免疫細胞亞類中的相關(guān)研究為深入探討它們在奶牛早期妊娠識別階段作用的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

[1] NAKAO T，SUGIHASHI A，KAWATA K，et al.Milk progesterone levels in cows with normal or prolonged estrous cycles，referenced to an early pregnancy diagnosis[J].JpnJVetSci，1983，45：495-499.

[2] MORTON J M，WYNN P C.Assessing ovulation detection performance in commercial dairy herds using progesterone concentrations from limited numbers of strategically collected milk samples[J].JDairySci，2010，93：3019-3030.

[3] ZOLI A P，GUIBAULT L A，DELAHAUT P，et al.Radioimmunoassay of a bovine pregnancy-associated glycoprotein in serum：its application for pregnancy diagnosis[J].BiolReprod，1992，46：83-92.

[4] FRICKE P M.Scanning the future - ultrasonography as a reproductive management tool for dairy cattle[J].JDairySci，2002，85：1918-1926.

[5] LUCY M C，MCDOUGALL S，NATION D P.The use of hormonal treatments to improve the reproductive performance of lactating dairy cows in feedlot or pasture-based management systems[J].AnimReprodSci，2004，82-83：495-512.

[6] SPENCER T E，BAZER F W.Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy[J].ReprodBiolEndocrinol，2004，2：49-63.

[7] BOTT R C，ASHLEY R L，HENKES L E，et al.Uterine vein infusion of interferon tau(IFNT) extends luteal life span in ewes[J].BiolReprod，2010，82(4)：725-735.

[8] GREEN J C，OKAMURA C S，POOCK S E，et al.Measurement of interferontau(IFN-tau) stimulated gene expression in blood leukocytes for pregnancy diagnosis within 18-20 d after insemination in dairy cattle[J].AnimReprodSci，2010，121：24-33.

[9] OLIVEIRA J F，HENKES L E，ASHLEY R L，et al.Expression of interferon(IFN)-stimulated genes in extrauterine tissues during early pregnancy in sheep is the consequence of endocrine IFN-tau release from the uterine vein[J].Endocrinology，2008，149(3)：1252-1259.

[10] GIFFORD C A，RACICOT K，CLARK D S，et al.Regulation of interferon-stimulated genes in peripheral blood leukocytes in pregnant and bred，Nonpregnant dairy cows[J].JDairySci，2007，90：274-280.

[11] HAN H，AUSTIN K J，REMPEL L A，et al.Low blood ISG15 mRNA and progesterone levels are predictive of non-pregnant dairy cows[J].JEndocrinol，2006，191：505-512.

[12] 謝勝松，李新云，蘇立杰，等.一種簡易快速鑒定動物組織總RNA質(zhì)量的方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2009，2：282-287. XIE S S,LI X Y ,SU L J,et al.A facile，rapid and effective method for RNA quality determination[J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2009，2：282-287.(in Chinese)

[13] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J].Methods，2001，25：402-408.

[14] BURTON J L，MADSEN S A，CHANG L C，et al.Gene expression signatures in neutrophils exposed to glucocorticoids：a new paradigm to help explain “neutrophil dysfunction” in parturient dairy cows[J].VetImmunolImmunopath，2005，105：197-219.

[15] SUKUMARAN B，CARLYON J A，CAI J L，et al.Early transcriptional response of human neutrophils to Anaplasma phagocytophilum infection[J].InfectImmun，2005，73：8089-8099.

[16] OTT T L，GIFFORD C A.Effects of early conceptus signals on circulating immune cells：lessons from domestic ruminants[J].AmJReprodImmunol，2010，64：245-254.

[17] BUSCH D C，WILSON D J，SCHAFER D J，et al.Comparison of progestin-based estrus synchronization protocols before fixed-time artificial insemination on pregnancy rate in beef heifers[J].JAnimSci，2007，85：1933-1939.

[18] COLAZO M G，KASTELIC J P，SMALL J A，et al.Resynchronization of estrus in beef cattle：Ovarian function，estrus and fertility following progestin treatment and treatments to synchronize ovarian follicular development and estrus[J].CanVetJ，2007；48：49-56.

[19] OTT T L，GIFFORD C A.Effects of early conceptus signals on circulating immune cells：lessons from domestic ruminants[J].AmJReprodImmunol，2010，64(4)：245-54.

[20] OLIVEIRA L J，MANSOURRI-ATTIA N，F(xiàn)AHEY A G，et al.Characterization of the profile of the bovine endometrium during the oestrous cycle and early pregnancy[J].PLoSONE，2013，8(10)：e75571.

[21] SAMUEL C E.Antiviral actions of interferons[J].ClinMicrobiolRev，2001，14：778-809.

[22] TOCHIZAWA S，OHMOTO Y，MORI T.A novel modification of a flow cytometric assay of phosphorylated STAT1 in whole blood lymphocytes for rapid detection of interferon-alpha signalinvivo[J].JImmunolMethods，2006，313：29-37.

[23] KIZAKI K，SHICHIJO-KIZAKI A，F(xiàn)URUSAWA T，et al.Differential neutrophil gene expression in early bovine pregnancy[J].ReprodBiolEndocrinol，2013，11：6.

(編輯 程金華)

Study onISG15 andOAS1 Transcriptions in Peripheral Blood of Dairy Cows during Early Pregnancy

CHENG Lei*，WANG Ding-fa，LIU Xiao-hua，XIANG Min，LING Ming-hu，HU Xiu-zhong，XIA Yu

(InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，WuhanAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan430208，China)

This study aimed to investigate mRNA transcriptions of interferon stimulated genesISG15 andOAS1 in the peripheral blood of Chinese Holstein dairy cows during early pregnancy，by which we hope to provide an insight into their applications in bovine early pregnancy diagnosis.A total of 27 heifers following spontaneous estrus(n=10) or oestrus synchronisation(n=17) were used for the study.Peripheral blood were collected at 0，14，18，21 and 28 d post artificial insemination(AI)；subsets of peripheral blood leukocytes(lymphocyte，monocyte，and natural killer cell) were isolated at 0，18 and 21 d；Real-time PCR was employed to detect the relative mRNA transcriptions ofISG15 andOAS1 in the whole white blood cells(WBC) and/or the leukocyte subpopulations.The results showed that bovineISG15 andOAS1 in the peripheral blood of pregnant cows were significantly elevated versus non-pregnant cows at 18 d(P<0.05)；On 18 d post AI，ISG15 was up-regulated in pregnant cows with the average fold change(FC) of 3.92，whereas it was down-regulated in non-pregnant cows with the average FC of 1.46；OAS1 was similarly up-regulated(FC=3.49) in pregnant cows and down-regulated(FC=1.28) in non-pregnant cows.The relative transcriptions ofISG15 andOAS1 in pregnant cows following spontaneous estrus were significantly higher than those in non-pregnant cows at 18 d post AI；although the tendency in cows following oestrus synchronisation was the same，the difference was not statistically significant.Further analysis in the subpopulations of leukocytes showed thatOAS1 in lymphocytes of pregnant cows was significantly elevated(+2.14)，whereas depressed in non-pregnant cows (-1.80) at 18 d post AI(P<0.05).The results indicated that regulations ofISG15 in peripheral blood of pregnant cows were more obvious thanOAS1 at 18 d after AI；differential expressions ofISG15 andOAS1 between pregnant cows and non-pregnant cows were more obvious in cows following spontaneous estrus.In conclusion，ISG15 transcriptions in peripheral WBC could be a better indicator for bovine early pregnancy diagnosis(18 d post AI)，especially in cows following spontaneous estrus.Gene expression analysis of bovineISG15 andOAS1 in the leukocyte subsets has provided additional insight into their roles during early maternal recognition of pregnancy.

dairy cows；ISG15；OAS1；pregnancy diagnosis；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.010

2014-07-11

武漢市農(nóng)科院人才發(fā)展專項基金(CX201240);武漢市農(nóng)科院青年英才計劃項目(YC201201)

程 蕾(1983-)，女，湖北天門人，畜牧師，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究

*通信作者：程 蕾，E-mail:chenglei_011@126.com

S823.9+1.2

A

0366-6964(2015)01-0077-08