王曉杜，趙凡凡，，代 兵，邵東華，蔣春英，周 圻＊，馬志永＊

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，臨安300311；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

病毒復(fù)制子指完全或部分去除病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，保留與復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白基因的病毒亞基因組，該亞基因組具有自主復(fù)制并表達病毒自身非結(jié)構(gòu)蛋白及插入的外源蛋白質(zhì)的能力，但是不包裝出具有感染性的病毒粒子。病毒復(fù)制子不僅是研究病毒基因結(jié)構(gòu)與功能技術(shù)平臺，也是表達外源蛋白質(zhì)［1］及研發(fā)疫苗的新型手段［2］。目前報道已經(jīng)構(gòu)建成功的復(fù)制子有甲病毒、小RNA病毒、黃病毒、冠狀病毒等RNA病毒的復(fù)制子，其中研究最為成熟的是甲病毒復(fù)制子，已作為真核表達載體研制成功，并且進行商業(yè)化生產(chǎn)。雖然以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的新型疫苗能較好的產(chǎn)生免疫力，保護動物免受感染［3］，然而甲病毒復(fù)制子對細胞毒性較強而導(dǎo)致細胞很快發(fā)生凋亡，所以其不能持續(xù)表達外源蛋白質(zhì)。黃病毒復(fù)制子能克服上述缺點，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：由于黃病毒復(fù)制子細胞毒性很小，能在細胞內(nèi)復(fù)制數(shù)十天；另外黃病毒屬病毒的RNA聚合酶保真性較高而保證黃病毒屬病毒復(fù)制子作為疫苗載體時免疫原性較穩(wěn)定；黃病毒屬病毒復(fù)制子的RNA相對較小，便于遺傳操作［4］。因此，黃病毒屬病毒復(fù)制子的研究將在基礎(chǔ)研究和疫苗開發(fā)研究方面極具價值。

豬日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是黃病毒科（Flaviviridaefamily）黃病毒屬（Flavivirus）重要的成員之一，同屬病毒還包括黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）、蜱傳腦炎病毒（tick－borne encephalitis virus，TBEV）和登革熱病毒（Dengue virus，DENV）等。JEV 病毒粒子直徑約50nm，病毒基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，包含一大的開放閱讀框，合成一條長的肽鏈，在細胞內(nèi)蛋白酶的作用下，合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（C）、基質(zhì)蛋白（prM）、囊膜蛋白（E）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5）［5］。JEV基因組5′端有I型帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppAmp），3′端不攜帶多聚腺苷酸尾。基因組5′和3′末端核苷酸都可形成高度保守的二級結(jié)構(gòu)，其與病毒的復(fù)制密切相關(guān)［6］，NS3、NS5基因編碼的復(fù)制酶復(fù)合體對病毒基因組復(fù)制和蛋白質(zhì)翻譯是必須的。作者通過改造本課題組前期構(gòu)建的JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆，去除其部分結(jié)構(gòu)基因（prM及E），構(gòu)建以CMV為啟動子的JEV復(fù)制子載體pAC－JEV，插入外源基因，驗證該載體具有自主復(fù)制能力和外源蛋白質(zhì)表達效果，為開發(fā)新型疫苗和研究JEV的復(fù)制機制提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含有JEV疫苗株SA14－14－2的基因片段質(zhì)粒pK－JEV由作者實驗室提供；質(zhì)粒pBluescript SK2（＋）、pcDNA3.1（＋）、pEGFP－N1、低拷貝質(zhì)粒pACYC－177由作者實驗室保存；小鼠抗JEV多克隆抗體由作者實驗室制備。

主要試劑：RT－PCR試劑盒、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶購自 TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、FITC－羊抗小鼠IgG、HRP－羊抗小鼠酶IgG、各種血清和細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒、DNA片段快速純化試劑盒購自Xygen公司；常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 含CMV啟動子的JEV復(fù)制子載體pAC－JEV的構(gòu)建

JEV復(fù)制子載體pAC－JEV、NS5缺失載體pAC－JEV－△NS5的結(jié)構(gòu)如圖1。構(gòu)建方法如下：以低拷貝質(zhì)粒pACYC－177為骨架，引入新的酶切位點（HindⅢ －EcoRⅠ－KpnⅠ－SalⅠ－XbaⅠ－XhoⅠ），將CMV啟動子插入新引入的酶切位點HindⅢ－EcoRⅠ間；之后分別將JEV結(jié)構(gòu)蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點間，命名該質(zhì)粒為pAC－CMV－CF2A；再以pK－JEV為模板，用NSⅠ－F及NSⅠ－R擴增JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NSⅠ，用NSⅡ－F及 NSⅡH－R1／R2／R3采用延伸PCR方法獲得NSⅡ＋HDVRz融合片段，將2個片段保存于－20℃?zhèn)溆?。利用XbaⅠ和XhoⅠ將NSⅡ＋HDVRz連接到pBluescript SK2（＋）上并命名為pBlue－NSⅡ＋HDVRz，以NheⅠ和XhoⅠ為酶切位點將polyA連接到pBlue－NSⅡ＋HDVRz，連接產(chǎn)物鑒定正確后經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切再連接到pAC－CMV－CF2A 上，將其命名為 pAC－exJEV，最后利用SalⅠ和XbaⅠ將NSⅠ連接到pAC－exJEV上，將最終的復(fù)制子載體命名為pAC－JEV。為了證明pAC－JEV的自主復(fù)制能力，利用突變PCR的方法，使得pAC－JEV的NS5基因缺失，構(gòu)建pACJEV－ΔNS5質(zhì)粒。擴增相關(guān)序列引物見表1。

表1 擴增引物序列Table 1 Primers for constructing the subgenomic replicon of JEV

1.3 轉(zhuǎn)染BHK－21細胞

利用pAC－JEV質(zhì)粒，將質(zhì)粒（2μg）轉(zhuǎn)染BHK－21細胞，具體方法參照Lipofectamine 2000說明書。通過方陣試驗確定質(zhì)粒與脂質(zhì)體用量的最佳比值，之后將質(zhì)粒染至24孔板單層BHK－21細胞，以pACYC－177空質(zhì)粒為陰性對照。

1.4 含EGFP報告基因復(fù)制子的構(gòu)建及表達檢測

以pEGFP－N1為模板，設(shè)計合成兩條引物EGFP－F／R（表1），PCR 擴增獲得EGFP基因，利用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切與pAC－JEV、pAC－exJEV相連接并命名為 pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP，測序驗證后，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染 BHK－21，同時以空載體pACYC－177為陰性對照，并在轉(zhuǎn)染后12h開始，每隔24h在熒光顯微鏡下觀察熒光變化。

1.5 Real－time PCR檢測復(fù)制子中EGFP 的轉(zhuǎn)錄能力

重組載體pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP分別轉(zhuǎn)染BHK－21細胞，轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h收取細胞樣品提取RNA，經(jīng)DNaseⅠ消化后取1μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。熒光定量PCR檢測EGFP基因片段引物序列，F(xiàn)：5′－AAGCAGAAGA－ACGGCATCAAGG－3′；R：5′－CACGAACTCCAGCAGGACCATG－3′。對每個樣品設(shè)定3次重復(fù)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，相對定量方法計算其RNA量的相對轉(zhuǎn)錄量。

1.6 IFA和Western blotting檢測復(fù)制子非結(jié)構(gòu)蛋白的表達

將細胞傳代于放置蓋玻片的30mm細胞培養(yǎng)皿中，細胞長至90%時轉(zhuǎn)染pAC－JEV質(zhì)粒4μg。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h收取相應(yīng)時間點的蓋玻片，陰性對照和陽性對照72h收取。IFA操作過程：細胞片經(jīng)甲醇∶冷丙酮（1∶1）－20℃固定20 min，PBS洗滌3次，1%BSA 37 ℃封閉30min，PBS清洗3次，每次10min；用1∶50稀釋的小鼠抗JEV多抗37℃孵育1h，PBS洗5次，每次10min；用1∶500稀釋的FITC－羊抗小鼠IgG為二抗37℃孵育30min，TBS洗3次，每次10min；1×DAPI室溫染色10min，TBS清洗3次之后用封片劑將蓋玻片固定于載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn) 染 pAC－JEV、pACJEV－△NS5（圖1）、pACYC－177、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5質(zhì)粒至30mm 內(nèi)BHK－21細胞中，以感染JEV細胞為陽性對照，正常細胞為陰性對照。72h收取細胞樣品，離心沉淀細胞。裂解液和超聲破碎提取細胞總蛋白質(zhì)，BCA法測蛋白質(zhì)濃度。取20μg總蛋白質(zhì)進行SDS－PAGE電泳，之后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至NC膜進行 Western blotting。將NC膜在小鼠抗JEV NS3（1∶1 000稀釋）多抗中4℃孵育過夜，TBST洗5次，每次5min；羊抗小鼠HRP酶標記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1h，TBST洗3次，每次5min，ECL試劑盒進行顯影，并把顯出來的膠片進行計算機掃描，保存和編輯圖片。

圖1 復(fù)制子及相關(guān)載體結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Schematic diagram of construction of the subgenomic replicon vector

2 結(jié) 果

2.1 JEV復(fù)制子相關(guān)載體pAC－exJEV、pAC－JEV、pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA 和GP5、pAC－JEV－△NS5－HA 和GP5的構(gòu)建

將CMV啟動子、HDVRz、PolyA終止子等元件引入質(zhì)粒pACYC－177中，在課題組此前構(gòu)建的JEV感染性克隆的基礎(chǔ)上，去除JEV結(jié)構(gòu)蛋白prM和E，構(gòu)建了保留全部非結(jié)構(gòu)蛋白的JEV復(fù)制子載體pAC－JEV（圖1）。為方便后續(xù)試驗的對照，再通過PCR方法缺失掉NS5羧基端部分基因序列而構(gòu)建的質(zhì)粒pAC－JEV－△NS5（圖1）。在pAC－exJEV和pAC－JEV復(fù)制子的基礎(chǔ)上，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，引入GFP、HA、GP5基因，構(gòu)建pACJEV－EGFP、pAC－exJEV－EGFP、pAC－JEV－HA、pAC－JEV－GP5質(zhì) 粒，在 pAC－JEV－△NS5 的 基 礎(chǔ)上，插入HA、GP5基因構(gòu)建pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5質(zhì)粒。以上構(gòu)建的質(zhì)粒均通過酶切、測序鑒定無誤后進行下一步試驗。圖1展示了部分質(zhì)粒構(gòu)建示意。

2.2 IFA驗證復(fù)制子非結(jié)構(gòu)蛋白的表達情況

將pAC－JEV轉(zhuǎn)染至BHK－21細胞，分別在24、48、72h取出蓋玻片，以小鼠抗NS3抗體為一抗，進行IFA檢測。試驗結(jié)果表明，24h時大多數(shù)細胞已經(jīng)表達JEV的NS3蛋白（圖2A），病毒蛋白質(zhì)位于細胞質(zhì)；隨著時間的延長，熒光的亮度有所增加（圖2A～C），說明JEV復(fù)制子具有自主復(fù)制能力。陽性對照組（JEV感染48h）幾乎全部細胞都有較強的熒光信號（圖2D）；而陰性對照組（轉(zhuǎn)染pAC－exJEV質(zhì)粒）細胞內(nèi)無熒光信號（圖2E）。該結(jié)果表明pAC－JEV復(fù)制子具有自我復(fù)制能力。

2.3 Western blotting 檢測復(fù)制子 pAC－JEV 的非結(jié)構(gòu)蛋白表達

載體pAC－JEV、pAC－JEV－ΔNS5分別轉(zhuǎn)染BHK－21，同時設(shè)置陽性（JEV感染48h）、陰性對照組（空白的BHK－21細胞），轉(zhuǎn)染96h后收取細胞樣品進行 Western blotting，β－actin作為蛋白質(zhì)樣品上樣量對照。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染96h后，pAC－JEV復(fù)制子載體還能表達JEV NS3蛋白（圖3），而對照的pAC－JEV－ΔNS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中，由于NS5（JEV復(fù)制的重要酶）的缺失，復(fù)制子的亞基因組復(fù)制能力受阻，NS3也就無法進行表達。該試驗進一步證明復(fù)制子pAC－JEV具有自我復(fù)制能力。

2.4 pAC－JEV－EGFP復(fù)制子表達報告基因EGFP

復(fù)制子載體pAC－JEV和帶有報告基因EGFP的pAC－JEV－EGFP質(zhì)粒各2μg，依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書上的方法，利用Lipofectamine 2000，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進BHK－21細胞，轉(zhuǎn)染后每隔12h，將轉(zhuǎn)染樣品置熒光顯微鏡下觀察一次，連續(xù)觀察8d。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染12h后即出現(xiàn)綠色熒光，該熒光可持續(xù)8d左右（圖4），并且熒光亮度逐漸增加，但是由于細胞培養(yǎng)時間的延長，期間發(fā)現(xiàn)部分陽性細胞變圓死亡現(xiàn)象。該試驗說明復(fù)制子載體pAC－JEV具有表達外源基因的能力。

2.5 Real－time PCR驗證JEV復(fù)制子表達外源基因的能力

JEV 復(fù)制子 pAC－JEV－EGFP和 pAC－exJEVEGFP轉(zhuǎn)染BHK－21細胞24、48、72和96h后，收集細胞提取細胞RNA，RT－PCR合成cDNA，Realtime PCR檢測樣品中的EGFP和β－actin轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：JEV復(fù)制子轉(zhuǎn)錄GFP的RNA量隨著轉(zhuǎn)染時間的延長呈逐漸增長趨勢，EGFPmRNA轉(zhuǎn)錄量在不同時間相對于陰性對照分別上升0.56倍（P＜0.05）、1.81倍（P＜0.01）、2.06倍（P＜0.01）和3.86倍（P＜0.01），而陰性對照組pAC－exJEV－EGFP中RNA的轉(zhuǎn)錄量幾乎沒有變化（圖5）。該試驗進一步說明復(fù)制子載體pAC－JEV具有表達外源基因的能力。

2.6 基于JEV復(fù)制子pAC－JEV的外源基因（GP5和HA）表達檢測

為了驗證JEV復(fù)制子表達外源基因的能力，攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5基因載體pACJEV－GP5和豬流感病毒HA基因載體pAC－JEVHA分別轉(zhuǎn)染BHK－21細胞，設(shè)定轉(zhuǎn)染pAC－JEV質(zhì)粒樣品為陽性對照，設(shè)定轉(zhuǎn)染pAC－JEV－△NS5、pAC－JEV－△NS5－HA、pAC－JEV－△NS5－GP5 質(zhì)粒樣品作為每一組的陰性對照。分別利用小鼠抗GP5和HA抗體進行檢測，小鼠抗JEV－NS3抗體作為JEV復(fù)制子的復(fù)制能力指示，β－actin作為蛋白質(zhì)樣品上樣量對照。結(jié)果表明：GP5和HA都能在BHK－21細胞內(nèi)表達，JEV復(fù)制子也能進行自主復(fù)制（圖6）。該試驗證明復(fù)制子載體pAC－JEV可以作為新型疫苗載體工具，開展多價疫苗的研究。

圖2 間接免疫熒光檢測JEV復(fù)制子載體非結(jié)構(gòu)蛋白的表達（40×）Fig.2 Identification of the nonstructural protein expressed by subgenomic replicon vector pAC－JEV by indirect immunofluorescence assay（40×）

圖3 Western blotting檢測非結(jié)構(gòu)蛋白NS3表達量Fig.3 Identification of expression level of the nonstructural protein by Western blotting

圖4 復(fù)制子pAC－JEV－EGFP在BHK－21細胞的表達（40×）Fig.4 Expression of the EGFP protein by JEV subgenomic replicon vector pAC－JEV－EGFPin BHK－21cells at various times after transfection（40×）

圖5 Real－time PCR檢測復(fù)制子在細胞內(nèi)RNA量的變化Fig.5 Detecting changes in amount of replicon RNA in cells by Real－time PCR

圖6 攜帶外源基因GP5和HAJEV復(fù)制子在BHK－21細胞中的表達Fig.6 GP5and HA were expressed in BHK－21cells by JEV replicon vector

3 討 論

病毒復(fù)制子作為能自主復(fù)制的病毒亞基因組，是研究病毒復(fù)制機制及研發(fā)新型核酸疫苗的理想工具。目前病毒復(fù)制子存在兩種形式：DNA型復(fù)制子和RNA型復(fù)制子。目前已經(jīng)構(gòu)建成功的多個黃病毒都 是 RNA 復(fù) 制 子，如 WNV［7］、YFV［8］、Kunjing［9］、JEV［10－11］，雖然 RNA 復(fù)制子能成功進行 體外復(fù)制，但是它具有操作繁瑣、不穩(wěn)定等缺點，但是仍有 部 分 構(gòu) 建 的 復(fù) 制 子 應(yīng) 用 到 疫 苗 研 究［12－15］。DNA復(fù)制子采用CMV啟動子和BGH poly（A）尾巴作為轉(zhuǎn)錄元件，無需進行體外轉(zhuǎn)錄、可直接轉(zhuǎn)染細胞進行表達，并且能作為DNA疫苗直接進行免疫動物，在疫苗研究方面具有良好的應(yīng)用前景。J.Li等將病毒復(fù)制子成功應(yīng)用到甲病毒快速檢測中［16］，這為病毒復(fù)制子應(yīng)用拓展了新的思路。

JEV病毒為單股正鏈RNA病毒，其復(fù)制特點為非結(jié)構(gòu)蛋白（組裝成復(fù)制相關(guān)酶）可以完成病毒亞基因組的復(fù)制［6］，因此本研究利用該特點構(gòu)建能自主復(fù)制的JEV復(fù)制子。本研究中作者以JEV弱毒株SA14－14－2感染性克隆為基礎(chǔ)，構(gòu)建了JEV的DNA型復(fù)制子表達載體，選用CMV為啟動子、BGH poly（A）為終止子以保證復(fù)制子亞基因組的轉(zhuǎn)錄起始和終止，亞基因組中去除結(jié)構(gòu)蛋白基因prM和E，避免病毒粒子的包裝，降低生物安全風(fēng)險。由于有文獻報道結(jié)構(gòu)蛋白C的完整性會對病毒的復(fù)制產(chǎn)生一定的影響［17］，因此本研究構(gòu)建JEV復(fù)制子保留了結(jié)構(gòu)蛋白C全基因序列，并在C基因序列的后面添加口蹄疫病毒的2A蛋白基因序列（FMDV－2A），其作用是利于細胞內(nèi)的蛋白激酶將有效地分開結(jié)構(gòu)蛋白C和后面多克隆位點插入的外源蛋白質(zhì)［18］。本研究的復(fù)制子還保留E蛋白基因羧基端66個堿基，這段序列的存在保證了JEV NS1蛋白的正確剪切和加工［10］，同時也有利于病毒復(fù)制酶的正確切割和組合。為使JEV復(fù)制子亞基因組的3′端呈天然病毒RNA狀態(tài)，在JEV 3′UTR后端添加丁肝病毒核酶（HDVRz）識別序列［19］，保證JEV復(fù)制子RNA的3′UTR的正確性，有利于相關(guān)酶的識別，從而保證復(fù)制子亞基因組的復(fù)制。

在本研究中，為了驗證該復(fù)制子載體自主復(fù)制能力，利用NS3蛋白作為指示，間接免疫熒光和Western blotting檢測，轉(zhuǎn)染后24～96h，NS3表達逐漸增加。因為NS5蛋白是JEV關(guān)鍵的復(fù)制酶［20］，將其缺失后病毒無法進行自主復(fù)制，NS5蛋白基因缺失組（pAC－JEV－△NS5）無法檢測到 NS3的表達。同時本研究也利用Real－time PCR檢測了JEV復(fù)制子的NS3mRNA轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果也說明隨著轉(zhuǎn)染時間延長，復(fù)制子組NS3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加（數(shù)據(jù)沒有顯示）。以上結(jié)果說明JEV復(fù)制子pAC－JEV具有自主復(fù)制能力。

JEV復(fù)制子具有持續(xù)表達外源蛋白質(zhì)EGFP能力，并可以一直持續(xù)到8d以后（圖4），國內(nèi)外學(xué)者有相似的研究結(jié)果［10－11］，但是本研究所構(gòu)建的復(fù)制子為DNA型復(fù)制子［CMV為啟動子、BGH poly（A）為終止子］，具有來源簡單（質(zhì)粒來自大腸桿菌）、操作方便（不需要體外轉(zhuǎn)錄和RNA的純化），表達外源蛋白質(zhì)穩(wěn)定，GP5和HA等其他病毒蛋白質(zhì)也能表達（圖6）。該特點將有利于研究開發(fā)多聯(lián)疫苗，也為研究JEV復(fù)制機制提供新的工具。

4 結(jié) 論

基于JEV的SA14－14－2毒株成功構(gòu)建DNA型復(fù)制子載體，各種不同方法證明該復(fù)制子pAC－JEV具有自主復(fù)制能力，在該復(fù)制子中插入外源基因GFP、GP5、HA，都能在細胞中表達，并且表達持續(xù)時間可達到8d以上，證明該復(fù)制子具有較強表達外源蛋白質(zhì)能力。本研究構(gòu)建的復(fù)制子將為研究JEV各病毒基因和蛋白質(zhì)功能及復(fù)制子多價疫苗研究奠定了基礎(chǔ)和提供新的工具。

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