劉桂萍， 趙琪銳， 楊賀龍

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

利用豆腐黃水發(fā)酵生產酵母單細胞蛋白的研究

劉桂萍， 趙琪銳， 楊賀龍

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

以豆腐黃水為液體培養(yǎng)基，酵母紅-2為發(fā)酵菌種，研究不同培養(yǎng)條件對發(fā)酵生產酵母單細胞蛋白的影響，通過正交實驗確定最佳發(fā)酵條件.實驗結果表明：當豆腐黃水體積分數(shù)為70 %、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量7 %、裝液量為50 mL/250 mL三角燒瓶、150 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)37 h后,酵母單細胞蛋白產量可達4.15 g/L，其蛋白質量分數(shù)達27 %以上.

豆腐黃水； 酵母菌； 發(fā)酵； 單細胞蛋白

大豆是世界上產量最多的油料作物，是人類植物蛋白和食用油的主要來源之一.我國大豆食品工業(yè)發(fā)展迅速，產生的食品廢水也隨之增多.大豆蛋白廢水含有大量的糖、蛋白質和脂肪類有機物，且不含有毒有害物質，是培養(yǎng)酵母菌生產單細胞蛋白的理想原料[1].利用豆腐廢水生產單細胞蛋白，不僅可以有效地利用廢水中的營養(yǎng)成分，減少環(huán)境污染，而且能帶來較高的經(jīng)濟效益，延長產業(yè)鏈，促進循環(huán)經(jīng)濟的發(fā)展.

我國已有生產單細胞蛋白的研究，徐堅平等利用秸稈進行微生物發(fā)酵生產單細胞蛋白[2].邵偉、吳鈺潔等以豆制品生產廢水為主要原料，大量培養(yǎng)熱帶假絲酵母，實現(xiàn)了豆制品生產廢水資源化利用的目的[3].代小江等利用微生物混合培養(yǎng)物生產沙棘果渣單細胞蛋白[4].寧夏大學李亞蕾、楊波等用玉米秸稈生產單細胞蛋白，并研究了菌種選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[5].王軍、郝新艷等用苧麻生物脫膠廢水生產熱帶假絲酵母單細胞蛋白，從而處理了苧麻廢水[6].王定昌、賴榮婷的研究表明酵母菌含有極豐富的蛋白質，具有人體所必需的八種氨基酸和B族維生素、維生素D、脂肪、粗纖維、碳水化合物、礦物元素等，同時還含有豐富的酶系統(tǒng)和生理活性物質[7].因此，利用有機廢水發(fā)酵生產酵母單細胞蛋白，不僅能為人類提供營養(yǎng)豐富的單細胞蛋白產品，還可以凈化有機廢水，實現(xiàn)廢水資源化利用，具有一定的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益[8].

本實驗以實驗室自篩紅酵母-2為發(fā)酵菌種，豆腐黃水為培養(yǎng)基，在不添加任何其他營養(yǎng)成分的條件下，通過設計正交實驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為豆制品廢水的綜合利用提供參考.

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

豆腐黃水，由某豆腐作坊生產水豆腐所得；菌株，實驗室冰箱保藏酵母菌，編號為酵母紅-2.

麥芽糖、硝酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀等均為分析純；酵母膏；瓊脂. 精科FA-1004電子天平；上海陽光SW-CJ-1B超凈工作臺；申安LD2x-50KB滅菌器；湖南凱達低速離心機TD5A；美菱冰箱BCD-205A；國華SHA-B恒溫振蕩箱；上海精宏電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9240A；上海天美紫外可見分光光度計UV1100.

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(質量分數(shù))：麥芽糖5 %，磷酸二氫鉀0.25 %，磷酸氫二鈉0.05 %，硫酸銨0.1 %，硫酸鎂0.1 %，硫酸亞鐵0.05 %，酵母膏0.05 %.

發(fā)酵培養(yǎng)基：取豆腐坊的豆腐黃水經(jīng)沉淀后，取上清液按一定比例加自來水配制而成.

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌種子液的制備及發(fā)酵培養(yǎng)方法

種子液的制備：取冰箱活化保存的酵母菌，用接種環(huán)接兩環(huán)于50 mL種子培養(yǎng)基中，在搖床轉速為150 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，制成種子液.

發(fā)酵條件：250 mL三角燒瓶裝入50 mL一定體積分數(shù)的豆腐黃水為發(fā)酵培養(yǎng)基，無需調整培養(yǎng)基pH，按9 %的接種量接入種子液，在搖床轉速為150 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)一定時間，發(fā)酵液離心測定生物量.

正交實驗設計：通過單因素實驗，選擇豆腐黃水濃度、溫度、接種量、裝液量4個影響較大的因素作為正交試驗的因素，選取L9(34)正交表，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，因素水平表見表1.

表1 因素水平表

1.3.2 酵母菌生長曲線及發(fā)酵時間的測定

將冰箱活化保存的酵母紅-2菌接兩環(huán)于種子培養(yǎng)基中，在25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)約24 h，每隔2 h取發(fā)酵液在595 nm處測定其吸光度值，繪制出生長曲線.按1.3.1發(fā)酵條件取體積分數(shù)為70 %的豆腐黃水為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)42 h,每2 h測定一次生物量，考察培養(yǎng)時間對單細胞蛋白產量的影響.

1.3.3 細胞生物量的測定

將發(fā)酵液轉入離心管中，以4 000 r/min離心20 min，自來水沖洗2次，去上清液得濕菌體；將濕菌體于60 ℃烘干24 h，達質量恒定，電子天平稱量，計算單細胞蛋白產量.

單細胞蛋白產量(g/L)=生物量干質量(g)/發(fā)酵液體積(L)

1.3.4 蛋白質含量測定

取50 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心20 min，收集酵母細胞.用質量分數(shù)為0.9 %氯化鈉洗滌細胞2次，離心得菌體細胞.將洗滌過的細胞配制成0.01 g/mL的細胞懸液，置于超聲波破碎儀中，將超聲波破碎儀的功率調到額定的80 %進行破碎細胞30 min,然后在-19 ℃的冰箱中冷凍30 min,用超聲波加冷凍組合處理菌體2次.隨后取0.2 mL樣品加入0.8 mL的蒸餾水、5 mL的考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2 min，然后在595 nm處測定其吸光度值[9].采用考馬斯亮藍法，以牛血清蛋白標準溶液為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[10].吸光度與蛋白質量的關系為：

Y=0.007 2x+0.010 7

(1)

R2=0.999 1

單細胞蛋白含水量=[(生物量濕質量-生物量干質量)/生物量濕質量]×100 %

(2)

蛋白質含量( %)=x·10-2×(1-含水量)

(3)

式中：Y—吸光度值；x—樣品中蛋白質量[11-13]，μg.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗優(yōu)化酵母紅-2發(fā)酵生產單細胞蛋白條件

2.1.1 酵母紅-2生長曲線的測定

酵母菌的生長周期分為4個時期：調整期，對數(shù)期，穩(wěn)定期，衰亡期.通過測定其生長曲線來探究酵母菌的生長特性，確定最佳制種時間，結果如圖1.由圖1可以看出：酵母紅-2生長曲線整體上符合S型曲線，前1～15 h酵母的OD值緩慢增加，為酵母菌的調整期；在15～20 h過程中OD值呈現(xiàn)對數(shù)增加的趨勢，為酵母菌的對數(shù)生長期；到22 h后生物量達到最大值，然后開始衰亡，以后為酵母菌的衰亡期.所以，在種子液的制備中取培養(yǎng)18 h的發(fā)酵液作為種子液.

圖1 酵母紅-2生長曲線

2.1.2 培養(yǎng)時間對酵母菌發(fā)酵的影響

按照9 %的接種量將種子液接種于體積分數(shù)為70 %的豆腐黃水液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床轉速為150 r/min、28 ℃下振蕩培養(yǎng)42 h，考察培養(yǎng)時間對單細胞蛋白產量的影響.由圖2可以看出：酵母生長曲線整體上符合S型曲線，前0～15 h為酵母的延滯期，生物量基本保持不變.和圖1相比，延滯期相對延長，可能與發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源和種子培養(yǎng)基不同有關，不利于酵母菌種的生長.15～36 h過程中生物量呈快速增加趨勢，到36 h后生物量基本保持不變，到達穩(wěn)定期，所以，在以后發(fā)酵試驗中，發(fā)酵時間選擇36 h.

圖2 培養(yǎng)時間對單細胞蛋白產量的影響

2.1.3 豆腐黃水體積分數(shù)對酵母菌發(fā)酵的影響

取一定體積分數(shù)的豆腐黃水為發(fā)酵培養(yǎng)基，按1.3.1實驗方法中的發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)36 h，考察豆腐黃水體積分數(shù)對其生物量的影響.結果見圖3.從圖3可以看出：豆腐黃水體積分數(shù)對酵母菌發(fā)酵生產單細胞蛋白有一定的影響，在一定濃度范圍內生物量隨豆腐黃水濃度的升高而呈上升的趨勢.豆腐黃水能為菌體生長提供所需的碳源、氮源，當豆腐黃水體積分數(shù)太低時，發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質不足以滿足酵母的生長，導致生物量產量不高；當豆腐黃水體積分數(shù)太高時，達到100 %時，發(fā)酵培養(yǎng)基黏稠，反而不利于了酵母的生長，影響單細胞蛋白產量.因此，選擇質量分數(shù)為80 %的豆腐黃水作為發(fā)酵培養(yǎng)基.

圖3 豆腐黃水體積分數(shù)對單細胞蛋白產量的影響

2.1.4 培養(yǎng)溫度對酵母菌發(fā)酵的影響

以體積分數(shù)為80 %的豆腐黃水為培養(yǎng)基，按1.3.1實驗方法發(fā)酵培養(yǎng)，考察培養(yǎng)溫度對其發(fā)酵的影響.結果如圖4.

圖4 發(fā)酵溫度對單細胞蛋白產量的影響

從圖4可以看出：溫度對酵母發(fā)酵有顯著的影響.溫度可以影響菌體細胞內酶的活性，進而影響到蛋白質的合成.每種菌都有自己的最適溫度，由圖4可以看出酵母紅-2的最適生長溫度為30 ℃.

2.1.5 接種量對酵母菌發(fā)酵的影響

按1.3.1實驗方法，以體積分數(shù)為80 %的豆腐黃水為培養(yǎng)基，按不同的接種量接入種子液，30 ℃條件發(fā)酵培養(yǎng)，考察接種量對其發(fā)酵的影響.結果如圖5.

圖5 接種量對單細胞蛋白產量的影響

從圖5可以看出：接種量對酵母的生長也有較大的影響.隨著接種量的增大，單細胞蛋白產量也逐漸增大.這是因為接種量過少，細胞量不足，易造成生長延遲，而增大接種量能夠縮短延遲期.但當接種量超過8 %時，雖然可使發(fā)酵周期縮短，但由于養(yǎng)分消耗過快，也不利于微生物細胞持續(xù)增長和產物合成，使得單細胞產量下降.因此，選擇8 %為最適接種量.

2.1.6 發(fā)酵液初始pH值對酵母菌發(fā)酵的影響

以體積分數(shù)為80 %的豆腐黃水為培養(yǎng)基，按8 %的接種量接入種子液，30 ℃條件發(fā)酵培養(yǎng)36 h，考察pH值對其生物量的影響.結果如圖6.

圖6 pH值對單細胞蛋白產量的影響

酸性環(huán)境適合于酵母菌的生長，而豆腐黃水的pH值又在4～5，因此，選擇不同的酸性環(huán)境來考察酵母的最佳生長狀況.由圖6實驗結果可以看出：不同的發(fā)酵液初始pH值對酵母生長的影響不大，因此，選擇豆腐黃水的自然pH值為4.5.

2.2 正交實驗優(yōu)化酵母菌發(fā)酵生產單細胞蛋白條件

按表1進行正交實驗，在搖床轉速為150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，正交實驗結果如表2.

表2 正交實驗結果

表中各因素水平K值的均值表示該因素在各水平值的平均結果，K值越大，代表該因素在各個水平時的評價結果越好，由此可判斷各因素最佳水平值的大小.由實驗結果可以看出：理論最佳發(fā)酵條件為：A2B2C1D2，即豆腐黃水體積分數(shù)70 %，培養(yǎng)溫度30 ℃，接種量7 %，裝液量50 mL.在此條件下進行3組驗證性實驗，得出單細胞蛋白的平均產量為4.15 g/L.

表中極差代表該因素對實驗結果的影響程度，極差越大，表明該因素對結果的影響程度越大.通過對表1的極差分析可知，影響單細胞蛋白產量的因素由大到小次序為：裝液量>培養(yǎng)溫度>豆腐黃水濃度>接種量.

2.3 發(fā)酵生產的酵母菌單細胞蛋白含量的測定

按1.3.4實驗方法，用超聲波加冷凍組合處理2次菌體后，在595 nm下測定吸光度值為0.791，帶入Y=0.007 2x+0.010 7 ，蛋白量為108.375 mg/L，從而測得菌體蛋白質量分數(shù)可以達到27 %以上.

3 結 論

以實驗室保藏酵母菌酵母紅-2為發(fā)酵菌株，在豆腐黃水中進行發(fā)酵培養(yǎng)菌體，并對菌體所含蛋白進行了測定，得出以下結論：

確定發(fā)酵生產單細胞蛋白的最佳條件：豆腐黃水體積分數(shù)為70 %，培養(yǎng)溫度30 ℃，接種量7 %，裝液量250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基50 mL，在該條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 h后酵母單細胞蛋白的產量為4.15 g/L，其菌體蛋白含量達到27 %以上.影響單細胞蛋白產量的因素由大到小次序為：裝液量>培養(yǎng)溫度>豆腐黃水濃度>接種量.

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Single-cell Protein by Using Bean Curb-farm Waste Water

LIU Gui-ping, ZHAO Qi-rui, YANG He-long

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

With curb-farm waste water as the liquid medium and yeast red-two as the fermentation strain,the influence of different culture conditions on yeast fermentation to produce single cell protein is studied.By orthogonal experiments it is determined that the best condition for fermentation is that with curb-farm water concentration of 70 %,temperature of 30 ℃,inoculation amount of 7 %,liquid volume of 50 mL/250 mL,single-cell protein production can reach 4.15 g/L,and protein content 27 %.

bean curb-farm waste water； yeast； fermentation； single-cell protein

2013-10-08

國家及遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310149014)

劉桂萍(1960-)，女，吉林鎮(zhèn)賚人，教授，主要從事環(huán)境污染生物治理與廢物資源化利用方面的研究.

2095-2198(2015)02-0113-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.004

TQ926.3

A