韓 曼 馬 莉 王 菲 于遠(yuǎn)望

陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(咸陽712046)

參附芎澤方對心衰大鼠血流動力學(xué)及心肌纖維化的作用*

韓 曼 馬 莉 王 菲 于遠(yuǎn)望△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(咸陽712046)

目的：觀察參附芎澤方對冠脈結(jié)扎所致心衰大鼠血流動力學(xué)及心肌纖維化的干預(yù)作用并探討其相關(guān)機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組、方藥組。模型組、方藥組結(jié)扎冠狀動脈左前降支，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。方藥組每次經(jīng)口灌服參附芎澤濃縮液；假手術(shù)組、模型組灌服等劑量生理鹽水。各組干預(yù)8周后采用血流動力學(xué)檢測評價心功能，Masson染色觀察心肌纖維化程度，Western blotting檢測心肌TGF-β1表達(dá)的變化。結(jié)果：與模型組相比，方藥組左室舒張末壓(LVEDP)顯著降低，左室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)明顯升高；同時，方藥組可使心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積減少，心肌TGF-β1的表達(dá)降低。結(jié)論：參附芎澤方可改善冠脈結(jié)扎所致心衰大鼠的心功能，抑制心肌纖維化，其機(jī)制可能與降低心肌TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

心力衰竭(Heart failure, HF)是各種心血管疾病終末階段的共同表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全[1]。對HF發(fā)生機(jī)制的探索發(fā)現(xiàn)，心肌重塑是HF發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制，而心肌纖維化是心肌重塑的關(guān)鍵病理特征和重要形成原因。發(fā)生纖維化的心肌變得僵硬，心肌收縮與舒張功能障礙，心功能逐步減退，故心肌纖維化是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[2]。本文探討參附芎澤方對冠狀動脈結(jié)扎后心衰大鼠血流動力學(xué)與心肌纖維化的作用，以期為心梗后的心肌纖維化干預(yù)開辟新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)選用健康、雄性Sprgue-Dawley大鼠(260～290g)40只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物合格證號：SCXK(陜)2012-003)。動物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，12h晝夜循環(huán)光照，自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要藥品與試劑 戊巴比妥鈉購自Sigma；Western blotting相關(guān)試劑購自Amresco；兔抗TGF-β1多克隆抗體購自Abcam；肝素鈉注射液(天津生物化學(xué)制藥有限公司，產(chǎn)品批號：20111103)；中藥材購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，參附芎澤方藥由人參、黃芪、附子、川芎、丹參、澤瀉六味中藥構(gòu)成。將中藥制成煎煮液，生藥含量為2g/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BL-420A生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司)；HX-100E小動物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 心衰模型制備 實(shí)驗(yàn)動物稱重后以2%戊巴比妥鈉(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于自制手術(shù)臺上，對文獻(xiàn)介紹的冠狀動脈結(jié)扎法[3]進(jìn)行改良。首先采用無創(chuàng)性氣管插管行人工呼吸；其次手術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒，沿左側(cè)第3～4肋間隙做一約1～1.5 cm縱行切口，依次分離皮膚、筋膜、肋間肌，大鼠擴(kuò)胸器撐開肋間肌暴露心臟，用脫脂棉小心撕開心包膜擠出心臟，一次性縫合針快速從心尖處穿過(切勿穿透心肌)，左手持線將心臟輕輕拉出胸腔，心臟搏動減緩，右手持持針器將另一一次性縫合針從左心耳下緣中點(diǎn)處進(jìn)針，深度約0.15 cm，在肺動脈圓錐底部靠近冠狀靜脈的部位出針，迅速結(jié)扎(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)，結(jié)扎后左室壁顏色較周圍變淺，同時心電圖ST段抬高，證明結(jié)扎成功。取出心尖的一次性縫合線，將心臟送回胸腔，清除胸腔內(nèi)積血，排出胸腔內(nèi)氣體，連續(xù)縫合肋間肌、縫皮并對切口消毒。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，青霉素20萬U腹腔注射，連續(xù)3d，預(yù)防感染。

2.2 動物分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為2組，假手術(shù)組(10只)和冠脈結(jié)扎組(30只)，假手術(shù)組術(shù)中死亡2只，冠脈結(jié)扎組術(shù)中死亡8只，術(shù)后死亡2只。冠脈結(jié)扎組術(shù)后8周，大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、方藥組(10只)。方藥組每次經(jīng)口灌服參附芎澤濃縮液2 mL，總藥量相當(dāng)于成人給藥劑量的20倍；假手術(shù)組、模型組灌服等劑量生理鹽水，各組干預(yù)均為8周。

2.3 血流動力學(xué)指標(biāo)的測定 各組大鼠灌胃8周，于末次進(jìn)食24h后，稱重，2%戊巴比妥鈉(50～55 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，將充滿肝素生理鹽水的PE50導(dǎo)管，一端連接生物信號采集處理系統(tǒng)，一端沿右側(cè)頸總動脈插入左心室腔內(nèi)，待壓力曲線穩(wěn)定后，記錄5 min血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)：心率(Heart rate, HR)、平均動脈壓(Mean arterial pressure, MAP)、左室收縮壓(Left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒張壓末壓(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)及左室內(nèi)壓上升和下降最大速率(Left ventricular pressure maximum rising and falling rates, ±dp/dtmax)。

2.4 Masson染色觀察心肌纖維化的程度 血流動力學(xué)指標(biāo)檢測后，處死大鼠，取出心臟，生理鹽水沖洗,濾紙吸干，剪取左心室，部分置液氮轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱貯存，備檢測Western blotting；部分置于10%甲醛固定48 h后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片，行Masson三色染色(心肌纖維胞質(zhì)呈紅色、胞核深藍(lán)色，膠原纖維藍(lán)色)，顯微鏡下觀察拍照，并測定膠原纖維的容積比。

2.5 Western blotting法檢測心肌TGF-β1蛋白表達(dá)的變化 將貯存于-80℃冰箱中的心肌組織每個樣本取100 mg，裂解提取總蛋白。10% SDS-PAGE分離蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。1%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加Ⅰ抗(anti-TGF-β1)后，4℃過夜。將膜放入密封袋中加Ⅱ抗，室溫?fù)u床上輕搖1 h，化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 血流動力學(xué)的改變 各組大鼠HR、MAP無顯著性差異(P>0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVSP、±dp/dtmax顯著降低(P<0.05)，LVEDP則明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，方藥組大鼠 LVSP、±dp/dtmax顯著升高(P<0.05)，LVEDP則有所降低(P<0.01)，詳見表1。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)比較

注：與假手術(shù)組相比△P<0.05，◇P<0.01；與模型組相比▲P<0.05，◆P<0.01

3.2 心肌纖維化的改變 如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞間和血管周圍有少量的膠原纖維；模型組大鼠心肌細(xì)胞間和血管周圍可見分布彌散的片狀或小灶狀膠原纖維，其含量與假手術(shù)組相比顯著增加(P<0.01)；方藥組大鼠心肌膠原纖維含量較模型組明顯減少(P<0．05)，詳見表2。這一結(jié)果提示: 參附芎澤方能抑制心衰大鼠心肌膠原的沉積。

圖1 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化變化(400×)

組 別膠原纖維容積比假手術(shù)組12.34±1.67模型組 48.72±2.55△方藥組 23.63±0.45▲

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05

3.3 心室肌TGF-β1蛋白表達(dá)的變化 Western blotting法結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠TGF-β1表達(dá)顯著增多(P<0.01)，提示心肌中有細(xì)胞因子的浸潤；與模型組大鼠相比，方藥組大鼠TGF-β1表達(dá)明顯降低(P<0.05)，表明參附芎澤方能抑制心衰大鼠心肌中細(xì)胞因子TGF-β1的浸潤，結(jié)果如圖2與表3所示。

圖2 Western blotting 檢測各組大鼠心肌組織中

組別心肌組織TGF-β1的表達(dá)(相對于GAPDH)假手術(shù)組0.23±0.17模型組 0.79±0.22△方藥組 0.40±0.12▲

注：與假手術(shù)組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05

4 討 論 各種心血管疾病發(fā)展的終末期均可引起HF，對人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅。冠脈結(jié)扎術(shù)建立的心梗后HF是研究HF常用的動物模型，該模型能夠很好的模擬心梗后心肌肥大、心肌膠原沉積，并逐漸演變到HF的全部病理過程，模型呈現(xiàn)的HF和神經(jīng)內(nèi)分泌激活方式與人類心衰過程相似[3]。以往研究表明，冠狀動脈左前降支結(jié)扎4周后即可發(fā)生心室重構(gòu)，8～12周可發(fā)展成HF[4]。本實(shí)驗(yàn)通過直接測定大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：冠脈結(jié)扎8周后，反應(yīng)左心室收縮功能的指標(biāo)LVSP、±dp/dtmax比正常對照組有所下降，而反映左心室舒張功能的指標(biāo)LVEDP比正常對照組顯著增加，提示冠狀動脈左前降支結(jié)扎8周后，大鼠心臟的收縮與舒張功能均嚴(yán)重受損，達(dá)到HF的標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HF發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心肌重塑，心肌由三個密不可分的成分(心肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、毛細(xì)血管微循環(huán))構(gòu)成，這種構(gòu)成為HF提供了心肌重塑的靶點(diǎn)。其中，細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維組成，對心臟起到支持和保護(hù)作用，無論何種原因(包括心梗)引起心肌受損，只要病變持續(xù)，終將導(dǎo)致Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積增多、比例失調(diào)、排列紊亂，即，心肌纖維化[5]。發(fā)生纖維化的心肌變得僵硬，擴(kuò)張性下降，心肌收縮障礙，使得心臟功能逐步減退。本研究結(jié)果顯示，冠脈結(jié)扎后心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積增加，心肌纖維化顯著，經(jīng)方藥干預(yù)后，心衰大鼠心肌膠原纖維的沉積顯著減少，心肌纖維化的程度明顯降低。血流動力學(xué)檢測結(jié)果表明，冠脈結(jié)扎后心衰大鼠心功能降低，而經(jīng)方藥干預(yù)的大鼠心功能各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，這與兩組大鼠心肌纖維化的結(jié)果一致。

TGF-β1是重要的促纖維化生長因子，也是導(dǎo)致心肌纖維化諸多因素中最后的共同中介物之一，已被公認(rèn)是器官纖維化的治療靶標(biāo)[5-6]。研究表明：TGF-β1在各種原因引起的心肌纖維化中均有較高表達(dá)。在動物模型及患有心臟疾病的病患的心肌組織中都發(fā)現(xiàn)了心肌纖維化以及TGF-β1的過表達(dá)。Brook等發(fā)現(xiàn)TGF-β1雜合子小鼠比野型對照組小鼠心肌纖維化明顯減少，心功能明顯增加。Kuwahara等也發(fā)現(xiàn)阻滯TGF-β1可對大鼠心肌纖維化起到治療作用。本研究中冠脈結(jié)扎后心衰大鼠TGF-β1的表達(dá)增多，經(jīng)方藥干預(yù)后心衰大鼠心肌TGF-β1的表達(dá)明顯降低，這與兩組大鼠心肌纖維化的程度相一致，提示參附芎澤方通過降低心衰大鼠心肌TGF-β1的表達(dá)抑制心肌纖維化，從而改善心功能。

參附芎澤方由黨參、黃芪、丹參、附子、川芎、澤瀉組成，方中黨參和黃芪具有益氣強(qiáng)心作用，且可改善心肌能量代謝[7-8]，另外,黃芪還有心肌保護(hù)作用；丹參和川芎具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、清心除煩和滋補(bǔ)之功效作用[9]，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)丹參可抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成，具有良好的拮抗心肌重塑的作用[10]，川芎中的川芎嗪具有鈣離子拮抗作用，使血管舒張，降低心室后負(fù)荷，減輕心室重塑[11]；附子和澤瀉具有溫陽利水作用，減輕心室前負(fù)荷，改善心功能[12]。本研究結(jié)果提示，參附芎澤方對心衰大鼠心功能具有顯著改善作用，其機(jī)制之一可能通過減少心肌TGF-β1的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化實(shí)現(xiàn)的。

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(收稿2015-03-22；修回2015-04-15)

Effects of Shenfu Xiongze Decoction on Hemodynamics and Myocardiac Fibrosis in Heart Failure Rats

Han Man Ma Li Wang Fei et al

School of Basic Medicine，Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Obiective：To explore therapeutic effects of the Shenfu Xiongze Decoction on hemodynamics and myocardiac fibrosis in rats with heart failure (HF) induced coronary artery ligature. Methods: SD rats were randomly divided into three groups: sham operated group, model group and herbs group. The rats of modle group and herbs group received the ligation of left anterior descending artery, while the rats of sham group were accepted sham operation (without ligation of left anterior descending artery, the rest of the operation was the same as the model). The herbs group were fed with Shenfu Xiongze Decoction, sham group and model group were fed with saline. After 8 weeks, hemodynamic evaluation were conducted to determine the cardiac functions．Masson staining was used to observe the degree of myocardial fibrosis．The protein level of transforming growth factors-β1(TGF-β1) was detected by Western blotting. Results: Compared with model group, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) decreased in the herbs group. At the same time, left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular pressure maximum rising and falling rates (±dp/dtmax) increased significantly in the herbs group. Herbs reduced the degree of myocardial collagen deposition (P<0.01) and decreased the expression of TGF-β1. Conclusion: Shenfu Xiongze Decoction improves heart functions and inhibits myocardial fibrosis in rats with HF induced by coronary artery ligature by decreasing TGF-β1protein expression level．

Heart failure/traditional Chinese medicine therapy Hemodynamics Animal experimentation Rats @Shenfu Xiongze decoction

* 陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(13-LC066；13LC061)

心力衰竭/中醫(yī)藥療法 血流動力學(xué) 動物實(shí)驗(yàn) 大鼠 @參附芎澤方

R541.6

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.051

△通訊作者