陳瑩瑩， 苗 亮， 李明云， 張曉麗， 郭曉飛， 潘 娜， 陳 炯

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

基于18S rRNA、COⅡ基因的鮸魚(Miichthysmiiuy)系統(tǒng)發(fā)育分析

陳瑩瑩， 苗 亮， 李明云， 張曉麗， 郭曉飛， 潘 娜， 陳 炯

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

為了解鮸魚的系統(tǒng)發(fā)育地位，探索18S rRNA、COⅡ分子標(biāo)記對石首魚科系統(tǒng)分類的適用性，對鮸魚的18S rRNA基因、線粒體COⅡ基因進(jìn)行克隆、序列分析和構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：擴增得到鮸魚18S rRNA基因1305 bp，A+T含量為46.2%；COⅡ基因序列為854 bp，A+T含量為53.5%，有明顯的反G偏倚(15.2%)，含一個699 bp的ORF，編碼233個氨基酸；基于18S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示，鱸形目魚類聚為一個緊密的簇，該目中各科魚類間18S rRNA序列的同源性均大于97.8%，無法反映鮸魚在石首魚科中的系統(tǒng)發(fā)育情況。基于COⅡ序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示，鱸形目魚類分為2簇：包括鮸魚在內(nèi)的所有石首科魚類聚為一個大簇，其他各科聚為另一個大簇；其中鮸魚與黃唇魚親緣關(guān)系最近，二者序列相似性為97.4%。雖然石首科魚類聚成的簇中有些分支的自展支持率較低(<50%)，個別種類的聚類與傳統(tǒng)分類有所差異，但大部分聚類是一致的。結(jié)果既能豐富鮸魚的分子系統(tǒng)學(xué)資料，又可為研究鮸魚的系統(tǒng)發(fā)育地位及石首魚科魚類的進(jìn)化關(guān)系提供參考資料。

鮸魚; 18S rRNA; COⅡ; 系統(tǒng)發(fā)育

鮸魚(Miichthysmiiuy)俗稱黑鮸、米魚等，屬硬骨魚亞綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、鮸魚屬(Miichthys)，單屬單種，主要分布于太平洋西岸的近海，是中國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[1]。鱸形目是魚類中最大的一個目，有7000余種；石首魚科是鱸形目中最大的一個科，有210余種，該科魚類分布范圍廣、生活環(huán)境多種多樣、起源與進(jìn)化關(guān)系復(fù)雜，在物種分類和進(jìn)化關(guān)系方面仍存在較多分歧[2-4]。許多學(xué)者根據(jù)形態(tài)和解剖特征探討鮸魚的分類地位，但存在分歧，如Taniguchi根據(jù)腦顱的骨學(xué)特征將石首魚科魚類劃分為毛鲿魚式型、黃姑魚式型、叫姑魚式型、白姑魚式型和黃魚式型，其中鮸屬、毛鲿魚屬和部分黃姑魚屬物種歸毛鲿魚式型[5]；而Taniguchi根據(jù)椎骨特征將石首魚科魚類分為黃姑魚式型、叫姑魚式型、白姑魚式型、黃魚式型和梅童魚式型，其中鮸屬和黃姑魚屬歸為黃姑魚式型[6]；朱元鼎等[7]和成慶泰等[8]則根據(jù)鰾和耳石形態(tài)將石首魚科魚類分為叫姑魚亞科、白姑魚亞科、黃魚亞科等7個亞科，其中鮸魚屬、黃魚屬和梅童魚屬歸屬于黃魚亞科[7-8]。由于魚類形態(tài)特征會受生活環(huán)境、年齡、性別等因素的影響，且依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類也受到樣品及測量誤差等的限制，因此有必要使用其他方法作為補充。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)分類中，常用的分子標(biāo)記有16S、18S核糖體亞基基因(16S rRNA、18S rRNA)、線粒體COⅠ、COⅡ、D-Loop序列等。目前，已有學(xué)者克隆了包括鮸魚在內(nèi)的石首魚科魚類的16S rRNA、COⅠ等基因并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析[9-10]，但鮮少有基于18S rRNA 和線粒體COⅡ研究鮸魚系統(tǒng)分類地位的文獻(xiàn)。本文通過PCR擴增獲取鮸魚的18S rRNA和線粒體COⅡ序列，通過與其他魚類的序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討其起源情況和進(jìn)化地位，研究結(jié)果可與傳統(tǒng)形態(tài)分類互為補充，為研究石首魚科魚類的種系進(jìn)化和分子系統(tǒng)分類提供參考材料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用鮸魚為采自浙江寧波象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖的1齡魚，麻醉后解剖、剪取背部肌肉，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與PCR擴增

用常規(guī)酚/氯仿法[11]提取鮸魚肌肉組織DNA，并調(diào)整濃度至50 ng/μL。

根據(jù)魚類18 s rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計擴增引物，序列為：上游引物5′-ACGGGTAACGGGGAATCAGG-3′；下游引物5′-ACGGGCGGTGTGTACAAAGG-3′；根據(jù)鱸形目魚類COⅡ基因上、下游保守區(qū)域設(shè)計擴增引物，序列為：上游引物5′-ACATAACCSCTCTGYCACTTTC-3′；下游引物5′-GGAGYCACCAATCTTTAGCTTAA-3′。引物均由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL，包括2×Taq Premix-Dye(上海博彩生物科技有限公司) 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，滅菌水 7 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(18S rRNA和COⅡ引物退火溫度分別為58℃和52℃)，72 ℃延伸1min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Biospin膠回收試劑盒(Bioflux公司)純化回收目的片段，與pMD19-T 載體(TaKaRa公司)連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TGⅠ感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑陽性克隆送至上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 序列分析與系統(tǒng)樹構(gòu)建

從GenBank中下載22種硬骨魚綱魚類18S rRNA基因序列和32種鱸形目魚類COⅡ基因序列，所用序列的物種名稱及登錄號見圖1和圖2。將本實驗擴增得到的鮸魚18S rRNA序列和COⅡ基因序列與GenBank檢索序列用Clustal X1.83軟件進(jìn)行多重比對；用MEGA5.0軟件、以七鰓鰻(Geotriaaustralis)為外群用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ法)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，采用Bootstrap(重復(fù)數(shù)=1000)檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。

2 結(jié)果

2.1 鮸魚18S rRNA和COⅡ基因序列特征

擴增得到鮸魚18S rRNA基因序列1305 bp，堿基組成A、T、G、C分別為24.1%、22.1%、29.2%和24.6%，A+T含量(46.2%)低于G+C含量(53.8%)，編碼435個氨基酸。與其他鱸形目11種魚類(平均值為：A 24.0%、G 29.2% 、T 22.1%、C 24.7%)比對，各堿基含量基本相似。

擴增得到的鮸魚COⅡ序列854 bp，堿基組成情況A、T、G、C分別為28.5%、25.0%、15.2%和31.3%，A+T含量(53.5%)高于G+C含量(46.5%)，堿基組成有明顯的偏向性，G的含量明顯低于其他3種堿基，包含一個699 bp的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，編碼233個氨基酸。

2.2 基于18S rRNA基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 基于18S rRNA構(gòu)建的硬骨魚綱魚類分子系統(tǒng)樹(NJ法)

Bootstrap=1000；*表示外群。

采用NJ 法對23種硬骨魚的18S rRNA基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(圖1)。結(jié)果顯示：鮸魚與其他硬骨魚類聚為一個大簇；鮸魚與同屬石首魚科的腋斑白姑魚親緣關(guān)系最近，形成一個緊密的簇，序列比對顯示二者18S rRNA序列的同源性為100.0%；鱸形目中的各個科均聚在一個大簇中，該目各魚類18S rRNA序列的同源性范圍97.8%～100.0%，提示該科魚類可能有共同的進(jìn)化起源；另外，鱸形目魚類與鮭形目和胡瓜魚目親緣關(guān)系較近，而與鯉形目和鯰形目親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 基于COⅡ氨基酸序列的鱸形目魚類分子系統(tǒng)樹(NJ法)

Bootstrap=1000；*表示外群。

2.3 基于COⅡ序列的分子系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2為基于33種鱸形目魚類COⅡ氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹。結(jié)果表明：鱸形目魚類分為兩大系，其中棘魚科、隆頭魚科、刺魚科、管吻刺魚科、石鯛科、鮨科、鱸科、鱖科、鯖科分別相聚后再聚為一個大簇，而石首魚科單獨聚為另一個大簇；石首魚科中尖頭黃姑魚、尖頭黃鰭牙鰄、黃姑魚、白姑魚、雙棘原始黃姑魚、黃唇魚、鮸魚、日本白姑魚、美國紅魚、小黃魚、大黃魚、黑鰓梅童魚、梅童魚和棘頭梅童魚親緣關(guān)系較近，聚為一個大簇，而皮氏叫姑魚和叫姑魚則單獨聚為一個小簇；鮸魚與黃唇魚親緣關(guān)系較近，二者聚為一個小簇，序列比對顯示其COⅡ氨基酸序列同源性為97.4%。

3 討論

18S rRNA基因是編碼核糖體小亞基的基因，序列保守性較高，易于用通用引物擴增，較適合科級以上的物種之間的分子分類系統(tǒng)學(xué)研究，近年來在生物分子系統(tǒng)演化研究中得到廣泛應(yīng)用，是研究生物高級分類群系統(tǒng)演化最為理想的工具之一[12-15]。本文中擴增得到鮸魚18S rRNA基因部分序列1305 bp，構(gòu)建的進(jìn)化樹中顯示，鱸形目魚類聚為一個緊密的簇，序列比對顯示鱸形目各魚類18S rRNA序列的同源性均>97.8%；其中鮸魚與真鱸科魚類(雜色矮鱸、暗矮鱸)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其18S rRNA序列同源性卻分別也有99.1%和99.2%。程漢良等[16]的研究顯示簾蛤科6種貝類間18S rRNA基因序列的差異率均在3%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示18S rRNA序列適合作為簾蛤科系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標(biāo)記。本研究顯示18S rRNA序列可用于鱸形目各科間的系統(tǒng)發(fā)育研究，但在石首魚科中，鑒于18S rRNA序列的高保守性和GenBank中可用物種數(shù)據(jù)較少，18S rRNA不適合該科不同物種間的系統(tǒng)發(fā)育分析。要研究鮸魚與石首魚科其他魚類間的系統(tǒng)發(fā)育和演化關(guān)系，還需使用其他進(jìn)化速度更快、序列信息更豐富的分子標(biāo)記。

細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)是由線粒體基因編碼的蛋白之一，由3個基因(COⅠ、COⅡ和COⅢ)編碼的3個亞基構(gòu)成。COⅠ、COⅡ和COⅢ 具有進(jìn)化信息位點多、易擴增且相對較短的特點，是理想的DNA分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于分析親緣關(guān)系較近的種、種以下分類階元以及地理種群之間的分子系統(tǒng)關(guān)系，在水產(chǎn)動物研究中已多有報道，如柳淑芳等[9]和Lakra等[17]都使用COⅠ序列對石首魚科魚類進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，崔文濤等[18]用COⅡ序列分析蛸亞科的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。本文擴增得到鮸魚COⅡ序列854 bp，包含一個699 bp的ORF，編碼284個氨基酸?；贑OⅡ序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示：鱸形目33種魚聚成兩個大簇，其中石首魚科魚類單獨聚為一簇，而其他9個科聚為另一簇。在石首魚科中叫姑魚和皮氏叫姑魚首先與該科的其他魚類分開，二者單獨形成一簇，表明在石首魚科中皮氏叫姑魚和叫姑魚與其他魚類的分歧時間較早；鮸魚與黃唇魚首先聚為一簇，二者的COⅡ序列相似性為97.4%，表明二者親緣關(guān)系較近。

蒙子寧等[10]對中國石首魚類基于形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果認(rèn)為，叫姑魚亞科口小下位、牙齒細(xì)小、營標(biāo)準(zhǔn)底棲生活，是最先分化出來的一支。本研究的COⅡ系統(tǒng)樹也顯示叫姑魚屬與其他石首科魚類系統(tǒng)位置較遠(yuǎn)，這與陳泉酶[4]用16S rRNA基因序列對石首魚科進(jìn)行分析時得出的叫姑魚屬與其它石首魚科魚類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的結(jié)論相一致。本研究的COⅡ系統(tǒng)樹中，鮸魚與黃唇魚、白姑魚、雙棘原始黃姑魚、日本白姑魚、美國紅魚、小黃魚、大黃魚、黑鰓梅童魚、梅童魚和棘頭梅童魚聚為一簇，這與馬春艷等[19]基于RAG和Cheng等[20]基于Cytb和COⅠ基因?qū)κ佐~科魚類系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析的結(jié)果基本一致,也支持朱元鼎等[7]根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)特征將黃魚屬、梅童魚屬和鮸魚屬劃分在同一個黃魚亞科的觀點。但在本研究構(gòu)建的COⅡ系統(tǒng)樹中，這一簇中有多個小支的自展支持率偏低(<50%)，特別是其中白姑魚屬的日本白姑魚與同屬的白姑魚距離較遠(yuǎn)而與擬石首魚屬的美國紅魚優(yōu)先聚為一簇(自展支持率24%)，以及雙棘原黃姑魚與黃姑魚距離較遠(yuǎn)而與白姑魚優(yōu)先聚為一簇，這些均與傳統(tǒng)的分類觀點不相一致。因此，要更加全面、準(zhǔn)確地分析石首魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、評估鮸魚的系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化地位，一方面有待于數(shù)據(jù)庫中該科魚類分子標(biāo)記信息的不斷豐富，另一方面也可聯(lián)合采用其他多個進(jìn)化速率不同的分子標(biāo)記(如線粒體D-Loop區(qū)、ND基因等)做進(jìn)一步的分析。

綜上所述，本實驗克隆了鮸魚18S rRNA和線粒體COⅡ序列并進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，研究結(jié)果既有與傳統(tǒng)分類相互印證的地方，也有一些分歧之處，本研究結(jié)果可為探討鮸魚的起源、進(jìn)化和鱸形目及石首魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)生提供參考資料，并可作為傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的補充，在此基礎(chǔ)上今后仍需做更為深入、全面地研究。

[1]蘇錦祥. 魚類學(xué)與海水魚類養(yǎng)殖(第2版) [M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1993: 214-215.

[2]辛 儉, 張玉榮, 徐冬冬， 等. 基于線粒體16sDNA和COⅠ基因探討中國近海黃姑魚類的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[J]. 海洋與湖沼,2014,45(2):307-313.

[3]韓 冰. 黃姑魚和鮸魚的形態(tài)學(xué)特征及黃姑魚群體的遺傳學(xué)研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué),2007.

[4]陳泉梅.中國石首魚類分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 廣州：暨南大學(xué),2007.

[5]Taniguchi N. Comparative osteology of the sciaenid fishes from Japan and its adjacent waters-I. Neurocranium[J]. Japa Jour Ich, 1969a, 16(2):55-67.

[6]Taniguchi N. Comparative osteology of the sciaenid fishes from Japan and its adjacent waters-II. Vertebrae I bid[J]. Japa Jour Ich, 1969b, 16(4):153-156.

[7]朱元鼎, 羅云林, 伍漢霖. 中國石首魚類分類系統(tǒng)的研究和新屬新種的敘述[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1963.

[8]成慶泰, 鄭葆珊. 石首魚科. 中國魚類系統(tǒng)檢索(上冊)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1987. 317-324.

[9]柳淑芳, 陳亮亮, 戴芳群,等. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼在石首魚科(Sciaenidae)魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用[J]. 海洋與湖沼, 2010,41(2):223-232.

[10]蒙子寧, 莊志猛, 丁少雄,等. 中國近海8種石首魚類的線粒體16S rRNA基因序列變異及其分子系統(tǒng)進(jìn)化[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展,2004,14(5):514-521.

[11]Sambrook J, Ffitsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed [C]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

[12]郝家勝, 楊 群. 后生動物起源與進(jìn)化的分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2001,24(4):378-382.

[13]Giribet G, Okusu A, Lindgren A R, et al. Evidence for a clade composed of molluscs with serially repeated structures: Monoplacophorans are related to chitons[J]. Proc Natl Acad Sci, 2006, 103(20): 7723-7728.

[14]Passamaneck Y J, Schander C, Halanych K M. Investigation of molluscan phylogeny using large subunit and small-subunit nuclear rRNA sequences[J]. Mol Biol Evol, 2004, 32(1): 25-38.

[15]Martin J A, Pashey D P. Molecelar systematic analysis of butterfly family and some subfamily relationships (Lepidopterat Papilionidae)[J]. Ann Ent Soc Am, 1992,85:127-135.

[16]程漢良, 彭永興, 王 芳, 等. 6種簾蛤科貝類18S rRNA基因全序列比較分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2008,15(4):559-567.

[17]Lakra W S, Goswami M, Gopalakrishnan A. Molecular identification and phylogenetic relationships of seven Indian Sciaenids (Pisces: Perciformes, Sciaenidae) based on 16S rRNA and cytochromecoxidase subunit I mitochondrial genes[J]. Mol Biol Rep, 2009,36(5): 831-839.

[18]崔文濤, 劉立芹, 李紅梅, 等. 基于COⅡ基因序列的中國近海12種蛸亞科動物的分子系統(tǒng)進(jìn)化研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2013,34(3):21-27.

[19]馬春艷, 馬凌波, 倪 勇, 等. 基于RAG基因的中國近海13種石首魚科魚類系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2012,36(1):9-16.

[20]Cheng Y, Xu T, Shi G, et al. Complete mitochondrial genome of the miiuy croakerMiichthysmiiuy(Perciformes, Sciaenidae) with phylogenetic consideration[J]. Mar Gene, 2010, 3:201-209.

Phylogenetic analysis of miiuy croaker (Miichthysmiiuy) base on 18S rRNA and COⅡ

CHEN Ying-ying , MIAO Liang, LI Ming-yun, ZHANG Xiao-li,GUO Xiao-fei, PAN Na, CHEN Jiong

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, the 18S ribosomal RNA (18S rRNA) and cytochrome oxidase Ⅱ(COⅡ) of miiuy croaker,Miichthysmiiuywere sequenced by PCR and were analyzed for evaluating the phylogenetic position ofM.miiuyand the feasibility of these two gene for molecular phylogeny of Sciaenidae. The results showed that the sequenced 18S rRNA and COⅡ were 1305 bp and 854 bp in length, respectively. The (A+T) content of 18S rRNA and COII were 46.2% and 53.5%, respectively, and the COⅡ showed an anti-G bias (the content of G was 15.2%). The COⅡ sequence included an ORF of 699 bp, which encoded 233 amino acid residues. The NJ phylogenetic tree of 18S rRNA showed that all the Perciformes fish were grouped together into one single clade, the identity of 18S rRNA among Perciformes was>97.8%, which was not suitable for evaluating the phylogenetic position ofM.miiuyin Sciaenidae. The NJ phylogenetic tree of COⅡ showed that the Perciformes fish subdivided into two major polytomous groups, the Sciaenidae formed one group and the other family formed another.M.miiuyhad the closest relationship withBahabataipingensis, the homology of COⅡ betweent the two species was 97.4%. Although in the Sciaenidae topology, there were some different relationships from the traditionally morphological classification and several bootstrap values were <50%, the most relationships of the topology were consistent with tradition. The results of this study could enrich the molecular systematics data ofM.miiuy, and could provide information for phylogeny research ofM.miiuyand the family Sciaenidae.

Miichthysmiiuy; 18S rRNA; COⅡ; phylogenetics

2014-09-01；

2014-09-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(批準(zhǔn)號：2012AA10A403-4)資助；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃項目(IRT0734)資助；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(2012C12907)資助

陳瑩瑩，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物苗種繁育；E-mail:843157767@qq.com；

李明云，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向為遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)，E-mail:limingyun@nbu.edu.cn。

S917.4；Q953

A

2095-1736(2015)02-0008-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.008