張素輝，付利芝*，朱買勛，許國(guó)洋，徐登峰

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

山羊源化膿隱秘桿菌的分離與鑒定及自然感染病例的病理學(xué)觀察

張素輝1，2，付利芝1，2*，朱買勛1，許國(guó)洋1，徐登峰1

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

為了確診自然感染疑似化膿隱秘桿菌引起的山羊淋巴結(jié)炎病例病原，進(jìn)行了病原菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)和16S rRNA鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)、病理組織切片觀察。該病原菌染色鏡檢為革蘭陽性的絲狀、桿狀或棒狀細(xì)菌，VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為化膿隱秘桿菌，可信度為88%，16S rRNA鑒定與化膿隱秘桿菌相似性高于99%，判定該病原菌為化膿隱秘桿菌；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物和氟喹諾酮類藥物有高度的敏感性，對(duì)磺胺類藥物有一定的耐藥性；病理切片觀察到病羊心肌纖維變性，肺和腎小管管腔內(nèi)有漿液-纖維素性變性，肝有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)形成肝炎，肩前淋巴結(jié)脂肪變性，脾呈漿液-化膿性炎癥。結(jié)果表明，本次致使山羊淋巴結(jié)炎的病原菌為化膿隱秘桿菌，且病羊病理組織學(xué)變化為主要臟器的化膿性炎癥。

山羊；化膿隱秘桿菌；細(xì)菌學(xué)鑒定；16S rRNA鑒定；病理切片觀察

化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes)屬于隱秘桿菌屬成員，主要寄生在綿羊、山羊、豬、牛、野生反芻動(dòng)物等動(dòng)物的組織器官、黏膜和皮膚，并引起化膿性感染的一種條件性致病菌，感染該菌的動(dòng)物表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、乳腺炎、皮下膿腫等，懷孕母畜也可能伴有流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象，在產(chǎn)后母畜能引起子宮內(nèi)膜炎等[1-2]，同時(shí)可能引起人感染致病[3]，給人類健康帶來了重大的威脅。目前研究發(fā)現(xiàn)，化膿隱秘桿菌的毒力因子主要有溶血素(pyolysin，PLO)、膠原結(jié)合蛋白(CbpA)、神經(jīng)氨酸酶(Nan)及菌毛合成蛋白(Fim)，這些毒力因子主要侵害動(dòng)物紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及功能蛋白，降低機(jī)體免疫力，破壞免疫屏障，而常引起不同病原菌的混合感染[4]；在其治療方面抗生素類藥物均未收到良好的治療效果，基于其毒力因子，有學(xué)者建立了PCR和ELISA診斷技術(shù)[5-6]，B.H.Jost等[7]研發(fā)了此病以膠原結(jié)合蛋白作為抗原的疫苗，但臨床防治效果欠佳。目前國(guó)內(nèi)尚未有感染化膿隱秘桿菌引起山羊淋巴結(jié)化膿的病例研究報(bào)道，作者以自然感染化膿隱秘桿菌引起淋巴結(jié)化膿的山羊?yàn)椴±?，進(jìn)行了病原分離和鑒定以及病理學(xué)觀察。

1 材料與方法

1.1 臨床病例與樣本采集

感染疑似化膿隱秘桿的發(fā)病山羊，來源于重慶市永川區(qū)某養(yǎng)羊場(chǎng)，病羊多為成年山羊，臨床觀察其病變主要是肩前淋巴結(jié)和股前淋巴結(jié)發(fā)生一處或多處雞蛋大的膿皰(圖1)，膿皰內(nèi)膿汁質(zhì)地均勻如牙膏狀，呈白色至灰白色，無臭味。病羊精神沉郁，采食量下降，身體消瘦；懷孕母羊有流產(chǎn)現(xiàn)象。解剖取其發(fā)生膿腫的肩前淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)其為大量結(jié)締組織包裹，質(zhì)地堅(jiān)硬；脾和肺出現(xiàn)不同程度的出血。放血處死山羊，在無菌環(huán)境下，選擇肩前淋巴結(jié)化膿液分離細(xì)菌，采集肺、肝、心、脾、腎和肩前淋巴結(jié)，置于4%甲醛溶液固定。

1.2 細(xì)菌鑒定

1.2.1 細(xì)菌學(xué)檢查 在無菌環(huán)境下，選擇肩前淋巴結(jié)化膿液接種在含10%小牛血清TSA瓊脂培養(yǎng)基上，細(xì)菌純化后，革蘭染色鏡檢，觀察其形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定 將所純化細(xì)菌送樣至重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，應(yīng)用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)分離菌進(jìn)行系列生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌致病性試驗(yàn) 取健康昆明種小白鼠20只，隨機(jī)分為2組，取菌液調(diào)整濃度至1×109CFU·mL-1，其中一組分別腹腔注射菌懸液0.2 mL·只-1，另一組為對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射營(yíng)養(yǎng)肉湯0.2 mL，接種后觀察臨床癥狀，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖解和細(xì)菌分離，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.4 病原菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序及分析 按照試劑盒說明進(jìn)行病原菌基因組DNA提取，參照文獻(xiàn)[2]，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，上游引物5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。所得序列在NCBI上使用Blast進(jìn)行同源性搜索，采用MEGA 4軟件中的鄰接法，基于16S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，采用標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)操作，檢測(cè)該菌對(duì)氨芐青霉素等28種抗生素的敏感性，抑菌圈直徑<10 mm表示其對(duì)抗生素具有一定的耐藥性，10～15 mm的為中度敏感，>15 mm的為高度敏感。

1.3 病理切片檢查

頸動(dòng)脈放血處死山羊，無菌環(huán)境下采集病變組織，按常規(guī)方法進(jìn)行病理學(xué)觀察[8]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

從山羊肩前淋巴結(jié)的膿汁中分離到的細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)十分緩慢，培養(yǎng)72 h后仍觀察不到菌落；在含小牛血清的TSA瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，可觀察到直徑大小約0.3 mm黏性菌落。挑取單個(gè)菌落于含小牛血清的TSB肉湯37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后，試管底部出現(xiàn)黏性物質(zhì)，振搖后肉湯呈均勻霧狀。純培養(yǎng)物革蘭染色為陽性，鏡檢形態(tài)多樣，呈絲狀、桿狀或棒狀，單在或成叢，無明顯鏈狀存在(圖2)。

2.2 生化鑒定結(jié)果

使用VITEK2 Compact全自動(dòng)分析系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行生化鑒定，該菌為化膿隱秘桿菌，可信度88%，其生化鑒定結(jié)果見表1。

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種細(xì)菌的小鼠在24 h后出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍的癥狀，7 d后開始死亡，至第10天，死亡率達(dá)75%。剖檢小鼠，發(fā)現(xiàn)其肝表面嚴(yán)重出血，出現(xiàn)大量化膿灶；肺大面積出血；腸道嚴(yán)重液化，腹腔布滿化膿液，見圖3。取肝和心血分離細(xì)菌，在兔血的TSA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，平板上均長(zhǎng)出了與攻毒菌落一樣的半透明、β-溶血、表面光滑、邊緣整齊、灰白色小菌落，革蘭染色為陽性，形態(tài)與注射小鼠前細(xì)菌形態(tài)一致，而未接種細(xì)菌組對(duì)照小鼠未出現(xiàn)死亡。

圖1 山羊肩前淋巴結(jié)化膿Fig.1 Goat front shoulder lymph fester

圖2 分離菌革蘭染色結(jié)果，1 000×Fig.2 Gram stain results of isolates，1 000×

A.肝表面嚴(yán)重出血，化膿灶明顯；B.肺大面積出血；C.腸道液化，腹腔布滿化膿液A.Liver surface with hemorrhage and purulent lesions；B.Lung with a large area hemorrhage；C.Intestinal liquefaction and abdominal full of pus圖3 小鼠病變器官Fig.3 Diseased organs in mice

表1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

Table 1 Bacterial biochemical identification results

項(xiàng)目Items結(jié)果Results項(xiàng)目Items結(jié)果Results陰性控制-乳酸鹽產(chǎn)堿-硝酸鉀-桿菌肽耐受-吡嗪酰胺-焦谷氨酸?β?萘胺+2?萘基磷酸鹽-萘酚?AS?BI?葡萄糖醛酸+2?萘基?βD?吡喃半乳糖苷-丙二酸鹽+1?萘基?N?乙?；?βD?氨基葡萄苷-明膠+七葉靈檸檬酸鐵-葡萄糖+接觸酶-核糖+尿素酶-2?萘基?αD?吡喃葡萄糖苷+甘露醇-木糖+磷脂酰磷脂酶C-蔗糖+6．5%氯化鈉-乳糖+新生霉素耐受-β?葡萄糖醛酸酶+奧普托欣耐受-β?葡萄糖苷酸酶+磷酸酶-丙氨酸芳胺酶+

2.4 病原菌16S rRNA序列的擴(kuò)增與分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI上使用Blast進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其與化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes)相似性最高(高于99%)?；?6S rRNA基因，采用MEGA 4軟件中的鄰接法，將分離菌與隱秘桿菌屬的伯納德隱秘桿菌(Arcanobacteriumbernardiae)、溶血隱秘桿菌(Arcanobacteriumhaemo-lyticum)、化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes)，放線菌屬的牛放線菌(Actinomycesbovis)，動(dòng)彎桿菌屬的羞怯動(dòng)彎桿菌(Mobiluncusmulieris)和柯氏動(dòng)彎桿菌(Mobiluncuscurtisii)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌與隱秘桿菌屬的伯納德隱秘桿菌、溶血隱秘桿菌及化膿隱秘桿菌聚類，并與化膿隱秘桿菌形成一個(gè)進(jìn)化分支。這表明分離菌與隱秘桿菌屬的化膿隱秘桿菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近，見圖4。

圖4 化膿隱秘桿菌16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Arcanobacterium pyogenes 16S rRNA phylogenetic tree

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Susceptibility test results

藥物名稱Name藥物含量/(μg·disc-1)Concentration抑菌圈直徑/mmDiameter敏感性sensitivity藥物名稱Name藥物含量/(μg·disc-1)Concentration抑菌圈直徑/mmDiameter敏感性sensitivity先鋒必75>40S先鋒霉素Ⅵ3025．7S淋必治100>40S慶大霉素1024．6S氨芐西林10>40S奧復(fù)星523．8S頭孢曲松30>40S諾氟沙星1022．0S頭孢呋辛30>40S恩諾沙星519．2S阿奇霉素15>40S痢特靈30017．9S利福平5>40S培氟沙星1015．0M乙酰螺旋霉素30>40S紅霉素150R先鋒霉素Ⅴ3040S復(fù)方新諾明230R氟苯尼考7539．2S四環(huán)素300R強(qiáng)力霉素3036．5S潔霉素20R卡那霉素3032．6S甲氧芐啶50R丙氟哌酸530．8S克林霉素20R新霉素3026．3S磺胺異唑3000R

S.高度敏感；M.中度敏感；R.不敏感

S.Sensitive；M.Moderately sensitive；R.Insensitive

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 組織病理切片觀察

病羊組織病理學(xué)變化參見圖5～10。

圖5 病羊心病理組織變化，心肌纖維嚴(yán)重?cái)嗔?、變性，HE，400×Fig.5 The histopathologic changes of heart of sick goat，myocardial fibers were broken and degeneration，HE staining，400×

圖6 病羊肺病理組織變化，肺泡壁上出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)有漿液-纖維性異物，HE，100×Fig.6 The histopathologic changes of lung of sick goat，alveolar wall appared RBCs，the slurry filled with alveolar-fibrous foreign matter，HE staining，100×

圖7 病羊腎病理組織變化，腎小管上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)出現(xiàn)纖維樣異物，HE，400×Fig.7 The histopathologic changes of kidney of sick goat，tubular epithelial cell loss and the lumen filled with fiber-like foreign matter，HE staining，400×

圖8 病羊脾病理組織變化，大量脾淋巴細(xì)胞變性、壞死，壞死組織中充滿膿細(xì)胞，HE，400×Fig.8 The histopathologic changes of spleen of sick goat，a large number of spleen lymphocyte degeneration and necrosis，necrotic tissue filled with pus，HE staining，400×

圖9 病羊肝病理組織變化，肝內(nèi)有局部壞死灶，肝細(xì)胞崩解，紅細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，HE，400×Fig.9 The histopathologic changes of liver of sick goat，partial liver necrosis，hepatocytes disintegrated，RBCs and inflammatory cell infiltration，HE staining，400×

圖10 病羊肩前淋巴結(jié)病理組織變化，淋巴細(xì)胞廣泛壞死，大量紅細(xì)胞和脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，HE，400倍×Fig.10 The histopathologic changes of lymph nodes of sick goat，lymphocytes extensive necrotized，RBCs and fat cell infiltration，HE staining，400×

病理組織切片顯示，病羊心肌纖維大面積的斷裂，嚴(yán)重變性，見圖5；肺泡壁上出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，部分肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)漿液-纖維性異物，見圖6；腎小管上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)有纖維樣異物出現(xiàn)，見圖7；脾組織呈不同程度的變性、壞死，形成大小不等的化膿灶，化膿灶中大量的膿細(xì)胞聚集，呈漿液-化膿性病變，見圖8；肝局部性出血，呈變質(zhì)性肝炎，大量的肝細(xì)胞壞死，壞死灶內(nèi)肝細(xì)胞崩解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍肝組織出血，見圖9。肩前淋巴結(jié)組織呈嚴(yán)重的脂肪變性，脂肪細(xì)胞彌散性地浸潤(rùn)淋巴組織，并伴有大量的紅細(xì)胞，形成嚴(yán)重出血，見圖10。

3 討 論

化膿隱秘桿菌病是一種以化膿性炎癥為主的傳染病，而該菌屬于條件性致病菌，在外界環(huán)境發(fā)生如氣候、季節(jié)、長(zhǎng)途運(yùn)輸、寄生蟲感染和營(yíng)養(yǎng)不良等因素的改變引起動(dòng)物機(jī)體抵抗力降低時(shí)，帶菌動(dòng)物受到應(yīng)激而誘發(fā)該病。本試驗(yàn)中，從病羊化膿淋巴結(jié)的膿汁中分離到的病原菌，應(yīng)用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行系列生化鑒定其為化膿隱秘桿菌，其可信度為88%，其結(jié)果可能會(huì)因菌株傳代次數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間、人員觀察等一些人為因素致使系統(tǒng)判斷結(jié)果為假陽性[9]，同時(shí)，臨床上未有動(dòng)物感染化膿隱秘桿菌引起淋巴結(jié)炎的報(bào)道，故本病例未能經(jīng)過細(xì)菌形態(tài)和生化鑒定而直接判斷為化膿隱秘桿菌病。經(jīng)16S rRNA鑒定后，與化膿隱秘桿菌(登陸號(hào)：FN394982)相似性高達(dá)99%，從分子生物學(xué)方面證實(shí)了該病原菌為化膿隱秘桿菌，結(jié)合臨床及病理變化特點(diǎn)，最終確診該病例為化膿隱秘桿菌引起的淋巴結(jié)炎。

藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化膿隱秘桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類抗生素均屬于高度敏感藥物，對(duì)磺胺類藥物具有一定的抗藥性。但該病在臨床上治療效果不佳，其原因可能是由于化膿隱秘桿菌主要寄生在易感動(dòng)物的黏膜和皮膚，藥物不能夠充分達(dá)到病灶部位，如試驗(yàn)中的高敏藥物氨芐西林，其在反芻動(dòng)物體內(nèi)吸收較差，綿羊口服的生物利用度僅為2.1%，未能在臨床上得到良好的治療效果[10]。

山羊病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，病羊的肩前淋巴結(jié)和脾均出現(xiàn)了明顯的壞死，大量壞死的中性粒細(xì)胞聚集，形成大小不等的化膿灶，從而判斷該病原菌侵害了機(jī)體的免疫器官，先前未有相關(guān)的研究報(bào)道?；撾[秘桿菌能產(chǎn)生溶血素(PLO)和神經(jīng)氨酸酶(Nan)，PLO屬于膽固醇依賴性的溶細(xì)胞素家族(family ofcholesteroldpendent cytolysin，CDC)成員，此類毒素通過在真核細(xì)胞上形成孔隙從而發(fā)揮其溶細(xì)胞活性，PLO能溶解包括紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，在血平板上形成特異的β-溶血；神經(jīng)氨酸酶可以分解宿主細(xì)胞的唾液酸作為碳源，降低膜表面黏液的黏滯性，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)宿主的黏附、定植作用，便于病原菌進(jìn)入深層組織等，同時(shí)神經(jīng)氨酸酶的酸化作用增加了黏膜免疫球蛋白IgA對(duì)細(xì)菌蛋白酶的易感性，從而損害宿主的免疫應(yīng)答[11-12]。進(jìn)而可推斷該病原致病原因可能是化膿隱秘桿菌分泌的PLO引起大量的細(xì)胞溶解，尤其是免疫細(xì)胞的溶解，同時(shí)在神經(jīng)氨酸酶的影響下，大量的病菌深入動(dòng)物免疫器官，使得免疫器官崩解，而淋巴結(jié)和脾屬于機(jī)體的主要免疫器官，該菌侵襲這些免疫器官后，使組織形成病灶，故而在臨床主要表現(xiàn)為明顯的肩前和股前淋巴結(jié)炎。

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(編輯 白永平)

Isolation and Identification ofArcanobacteriumpyogenesfrom Goats and Pathological Observation of Naturally Infected Case

ZHANG Su-hui1，2，F(xiàn)U Li-zhi1，2*，ZHU Mai-xun1，XU Guo-yang1，XU Deng-feng1

(1.ChongqingAcademyofAnimalSciences，Chongqing402460，China；2.ChongqingEngineeringResearchCenterforGoat，Chongqing402460，China)

This study aimed to confirm the pathogens from purulent lymph goats infected naturally byArcanobacteriumpyogenes. The pathogens were isolated and cultured，identified by pathological method and 16S rRNA analysis.The result of bacterium analysis showed that the pathogen wasArcanobacteriumpyogenes，the credibility was 88% identified by VITEK2 Compact automated microbial analysis system and homology was 99% by 16S rRNA identification.The strain was highly sensitive to β-lactams antibiotics and fluoroquinolones，but resistant to sulfa drugs.Pathological sections showed the sick goat appeared myocardial fibrosis，lung and renal tubular lumen with serous-fibrinous degeneration，inflammatory cell infiltration induced hepatitis，spleen was serous-purulent inflammation and front lymph nodes near shoulders appeared steatosis.Thus we can summary that the pathogen of the goat lymphadenitis wasArcanobacteriumpyogenes.Histopathological changes were the main organs suppurative inflammation.

goat；Arcanobacteriumpyogenes；bacteriological identification；16S rRNA identification；pathological observation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.017

2015-04-17

重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014cstc-jbky-00108)；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)青年基金項(xiàng)目(31402149)

張素輝(1980-)，女，漢族，四川廣安人，副研究員，主要從事山羊疫病防控研究與推廣

*通信作者：付利芝，E-mail：446116409@qq.com

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0366-6964(2015)12-2251-07