趙東岳，陳金鋒，韋劍輝

(福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350117)

弓形蟲截短SAG2基因的克隆表達(dá)與免疫活性分析

趙東岳*，陳金鋒，韋劍輝

(福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350117)

構(gòu)建截短的弓形蟲表面抗原2(SAG2)原核表達(dá)系統(tǒng)，并探討其抗原活性。PCR擴(kuò)增去掉信號(hào)肽和C-末端的SAG2基因片段，插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-3后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，并用IPTG誘導(dǎo)。SDS-PAGE和Western blot鑒定重組SAG2t的表達(dá)及其免疫反應(yīng)原性。每升菌液約純化出4 mg rSAG2t蛋白；Western blot顯示，ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可強(qiáng)烈識(shí)別表達(dá)的截短SAG2蛋白。原核表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)了截短的SAG2蛋白的可溶性表達(dá)，并具有良好的完全抗原活性。

弓形蟲RH株/ME49株；免疫印記；截短SAG2基因

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是寄生在宿主有核細(xì)胞內(nèi)的一種原蟲，作為機(jī)會(huì)致病病原，引起人畜患病。弓形蟲感染懷孕母畜后，侵害胎膜、侵染胎兒的大腦和肺[1]，可導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒畸形，死胎。農(nóng)場(chǎng)的貝類水生動(dòng)物也有較高的弓形蟲感染率[2]，因此弓形蟲已經(jīng)嚴(yán)重威脅人畜健康，弓形蟲病的防治刻不容緩。弓形蟲表面抗原2(SAG2)基因?yàn)閱慰截惢?，無(wú)內(nèi)含子，SAG2蛋白也具有1個(gè)游離的N-末端信號(hào)肽和疏水性的C-末端，被GPI錨定[3]。C.D.Yang等[4]誘導(dǎo)的嵌合蛋白rSAG1/2具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力；A.V.Machado等[5]制備的SAG2基因疫苗，能夠強(qiáng)烈刺激宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫，因此SAG2抗原具有較強(qiáng)的免疫原性。本研究利用去除信號(hào)肽和C-末端的SAG2(438 bp)基因序列進(jìn)行克隆并在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，以便制備快速、準(zhǔn)確的抗體檢測(cè)的相關(guān)試劑盒。

1 材料與方法

1.1 蟲株、質(zhì)粒

剛地弓形蟲RH株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全教授友情提供；ME49株、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3，牛新孢子蟲，均由福建師范大學(xué)黃曉紅教授友情提供。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker、Primixed protein marker (Low)、TaKaRa ExTaq等均購(gòu)自TaKaRa公司；PVDF膜購(gòu)自Milipore公司；Giutathione sepharoseTM4B購(gòu)自GE Healthcare公司；DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank (FJ825705)所登錄的弓形蟲RH株SAG2基因序列，用Primer5.0設(shè)計(jì)信號(hào)肽(N-末端)和C-末端切割點(diǎn)之間的序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增438 bp。上下游引物的5′端添加限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)性堿基其序列分別為GAATTC和AC。由上海生工合成，引物序列如下，F(xiàn)：ACGAATTCGTCCACCACCGAGACG；R：ACGAATTCTTACTTGCCCGTGAGA。

1.4 截短SAG2片段的PCR擴(kuò)增

以提取的RH株弓形蟲全基因組為模板，根據(jù)TaKaRa ExTaq推薦的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系如下：TaKaRa ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL，10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus) 5 μL，DNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA，以備克隆。

1.5 重組質(zhì)粒的克隆與鑒定

純化回收的截短SAG2的PCR擴(kuò)增片段與表達(dá)載體pGEX-4T-3分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切暴露出黏性末端，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝回收，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，載體和目的基因SAG2t按照1∶3加樣，與等體積的SolutionⅠ混勻，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布到含有100 μg·mL-1的氨芐青霉素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h后用高純質(zhì)?；厥赵噭┖谢厥罩亟M質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.6 重組蛋白SAG2t的誘導(dǎo)表達(dá)、純化

挑取1個(gè)含有pGEX-4T-3-SAG2t重組表達(dá)質(zhì)粒的單克隆接種到含Amp(工作質(zhì)量濃度100 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)12～16 h，過夜培養(yǎng)的菌液按照1∶100的比列接種到含有Amp的LB培養(yǎng)基37 ℃搖培，當(dāng)OD600 nm為0.6～0.8時(shí)加入IPTG(工作濃度0.5 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)，在優(yōu)化的最佳誘導(dǎo)溫度25 ℃的條件下誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷TNE(含50 mmol·L-1Tris-Hcl pH8.0，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA)按照1∶50的比例懸浮菌體，并加入溶菌酶(工作質(zhì)量濃度100 μg·mL-1)靜置一段時(shí)間后，經(jīng)超聲破碎后，加入TritonX-100(工作濃度1%) 冰上放置30 min，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，離心后獲得可溶相和不可溶相。可溶相純化步驟按照Glutathione SepharoseTM4B(GE Healthcare)說明書操作。最后將可溶相，不可溶相，純化的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 Western blot分析

1.7.1 抗rSAG2t鼠血清的制備 由于rSAG2t含有GST標(biāo)簽蛋白，所以免疫小鼠時(shí)做GST對(duì)照。GST是由含有pGEX-4T-3質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生，粗提及純化方法同1.6。試驗(yàn)組小鼠注射100 μg的rSAG2t，對(duì)照組注射100 μg的GST。初次免疫：將500 μg蛋白質(zhì)稀釋成1 000 μL，與等體積的弗氏佐劑進(jìn)行乳化，分成5等分，分別注入5只小鼠腹腔；加強(qiáng)免疫：2周后以同樣的劑量蛋白懸液與等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化后腹腔注射，再間隔2周后同樣的劑量、同方法再次加強(qiáng)免疫，10 d后頸總動(dòng)脈取血，分離抗rSAG2t鼠血清。1.7.2 感染弓形蟲ME49株鼠血清制備 Vero細(xì)胞培養(yǎng)的弓形蟲弱毒株ME49蟲體，用PBS洗三遍，腹腔注射500只速殖子，感染前及感染后第7、10、14、20、27、38、45、54天分別經(jīng)小鼠尾部取血，分離血清。

1.7.3 重組蛋白SAG2t的Western blot分析 純化rSAG2t蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離膠和濃縮膠的濃度分別是12%和5%，每塊膠在恒流25 mA條件下電泳進(jìn)行濃縮，進(jìn)入分離膠時(shí)轉(zhuǎn)化電流為50 mA，待溴酚藍(lán)指示劑移到接近凝膠底部時(shí)立即停止電泳，然后電轉(zhuǎn)印PVDF膜(濕轉(zhuǎn)印條件：每塊膠恒壓120 V，轉(zhuǎn)印60 min)；用5%的牛血清白蛋白(2.5 g，BSA用50 mL，1×TBST溶解)進(jìn)行封閉；一抗：分別是弓形蟲感染的鼠血清和rSAG2t抗原免疫的鼠血清(1∶100稀釋)；二抗：標(biāo)記紅色熒光的抗鼠IgG抗體(1∶3 000)稀釋。

1.8 重組蛋白SAG2t為包被抗原的ELISA檢測(cè)

用重組SAG2t包被酶標(biāo)板，用ELISA方法分析感染弓形蟲ME49株的SPF鼠血清、SPF鼠陰性血清、感染新孢子蟲的SPF鼠血清，分析其抗原識(shí)別的特異性及其ME49株感染小鼠后特異性IgG抗體水平消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 截短SAG2的擴(kuò)增

從弓形蟲RH株全基因組DNA中擴(kuò)增的截短SAG2t(438 bp)基因片段，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在500 bp左右有一條清晰明亮的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相同。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. SAG2t片段；2.陰性對(duì)照M.DL2000 DNA marker；1.The fragment of SAG2t；2.Negative control圖1 去除信號(hào)肽和C-末端的SAG2編碼基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of encoding gene of SAG2 without signal peptide and c-terminal

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

pGEX-4T-3-SAG2t重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和酶切后，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在500和5 000 bp附近有兩條清晰明亮的條帶(圖2)。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照；3.重組質(zhì)粒的PCR鑒定；4.重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-SAG2t；5.pGEX-4T-3-SAG2t 重組質(zhì)粒酶(EcoRⅠ)切產(chǎn)物M．DL5000 DNA marker；1.Negative control；2.Positive control；3.Identification of recombinant plasmid pGEX -4T-3-SAG2t by PCR；4.Recombinant plasmid of pGEX-4T-3-SAG2t；5.Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by EcoRⅠ圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-SAG2t-PCR和雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pGEX-4T-3-SAG2t by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白SAG2t的表達(dá)、純化及Western blot分析

將rSAG2t的表達(dá)和純化結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳后分析發(fā)現(xiàn)，rSAG2t的相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)的41 ku相符；rSAG2t產(chǎn)量很高，粗略估計(jì)每升菌液中約純化出4 mg高純度的抗原，見圖3。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.上清；2.沉淀；3.純化的重組蛋白質(zhì)；4.GST對(duì)照；5～10.BSA，質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1M.Proteins with standard molecular mass；1.Soluble fraction；2.Insoluble fraction；3.Purified rSAG2t；4.GST；5-10.BSA with the concentration of 62.5，125，250，500，1 000 and 2 000 μg·mL-1圖3 SDS-PAGE分析rSAG2t的表達(dá)與純化結(jié)果Fig.3 The expression and purification of rSAG2t by using SDS-PAGE analysis

Western blot顯示，感染弓形蟲ME49株的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可強(qiáng)烈識(shí)別表達(dá)的截短SAG2蛋白，但是兩者均不與GST蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，見圖4。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.rSAG2t抗原+感染ME49株鼠血清；2.rSAG2t抗原+rSAG2t免疫鼠血清；3.GST抗原+感染ME49株鼠血清；4.GST抗原+rSAG2t免疫鼠血清M.Prestained-protein marker；1.rSAG2t+serum infected with T.gondii ME49 strain；2.rSAG2t+serum immunized by rSAG2t；3.GST+serum infected with T.gondii ME49 strain；4.GST+serum immunized by rSAG2t 圖4 Western blot分析顯示重組蛋白rSAG2t分別與感染ME49株鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清起強(qiáng)烈的抗原抗體反應(yīng)Fig.4 rSAG2t reacted strongly between serum infected with T.gondii ME49 strain and serum immunized by rSAG2t using Western blot analysis

2.4 重組蛋白SAG2t為包被抗原的ELISA檢測(cè)

由圖5可見，rSAG2t(2 μg·mL-1)包被酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA，發(fā)現(xiàn)感染弓形蟲ME49株的SPF鼠血清OD值升高，SPF鼠陰性血清和感染牛新孢子蟲的鼠血清OD值未升高，表明rSAG2t能夠特異性檢測(cè)出感染弓形蟲的抗體。圖6顯示，用ELISA追蹤感染ME49株小鼠血清在7～54 d的特異性IgG抗體水平消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，在感染7 d后可檢測(cè)到弓形蟲特異性IgG抗體，20 d后弓形蟲特異性IgG抗體水平達(dá)到高峰，隨后雖有所下降，但還是維持在較高的水平，該結(jié)果與IgG抗體水平消長(zhǎng)的規(guī)律相符。

圖5 rSAG2t特異性試驗(yàn)Fig.5 The specific test of rSAG2t

A、B、C、D、E、F、G、H.感染7、10、14、20、27、38、45、54 d特異性IgG抗體滴度A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H.Specific IgG antibody titers at 7，10，14，20，27，38，45 and 54 days post infection圖6 感染ME49株弓形蟲小鼠特異性IgG抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.6 Dynamic specific IgG antibody levels in T.gondii ME49-infected mouse

3 討 論

S.Tomavo等研究發(fā)現(xiàn)SAG2的N-端信號(hào)肽序列和C-末端脂錨錠蛋白具有高度的疏水性[6]。龍彩虹等構(gòu)建pGEX-4T-2-SAG2t，在E.coliDH5α中誘導(dǎo)出去除前導(dǎo)信號(hào)肽的SAG2(477 bp)[7]。雷明軍等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET23a-SAG2，在E.coliDH5α中誘導(dǎo)全長(zhǎng)SAG2(500 bp)[8]。黃燕等構(gòu)建pGEX-4T-SAG2t，在E.coliDH5α中誘導(dǎo)出去除疏水性信號(hào)肽的SAG2(451 bp)[9]。聶福旭等構(gòu)建重組質(zhì)粒pET23a-SAG2t，在E.coliBL21內(nèi)誘導(dǎo)出去除前導(dǎo)信號(hào)肽的SAG2[10]。S.Li等利用基于rSAG2構(gòu)建的rELISA方法，能夠特異性地應(yīng)用于孕婦弓形蟲的檢測(cè)，可有效區(qū)分急、慢性感染[11]。Y.L.Lau等在畢赤酵母中成功克隆、表達(dá)出去掉一半N-末端的SAG2，并且能夠識(shí)別感染弓形蟲的血清[12]。Y.L.Lau等在畢赤酵母中表達(dá)出全長(zhǎng)SAG2抗原蛋白，構(gòu)建檢測(cè)人弓形蟲病ELISA方法不僅能夠檢測(cè)急性感染患者(IgM+、IgG-)，也能夠檢測(cè)慢性感染患者(IgM-、IgG+)[13]。

從上述文獻(xiàn)的報(bào)道來看，SAG2抗原蛋白，能夠特異性的識(shí)別感染弓形蟲的動(dòng)物血清中IgM抗體和IgG抗體，但是上述文獻(xiàn)中所報(bào)道的SAG2抗原蛋白的表達(dá)量仍然比較低，為了提高SAG2抗原在大腸桿菌內(nèi)高產(chǎn)量的表達(dá)，本研究根據(jù)SAG2基因序列的特點(diǎn)，去除疏水性的信號(hào)肽序列和C-末端序列SAG2(438 bp)亞克隆到高效表達(dá)載體pGEX-4T-3，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中進(jìn)行高效誘導(dǎo)，結(jié)果表明每升菌液中可純化出的量高達(dá)4 mg。在試驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，IPTG的誘導(dǎo)終濃度在0.1～0.5 mmol·L-1之間誘導(dǎo)的量沒有明顯差異，與以上文獻(xiàn)報(bào)道的最佳IPTG濃度為0.1 mmol·L-1有所出入；試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的溫度對(duì)SAG2蛋白表達(dá)有至關(guān)重要的影響，本試驗(yàn)優(yōu)化的最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)表達(dá)量最高，也與以上文獻(xiàn)報(bào)道的有所不同，究其原因可能與表達(dá)載體有密切關(guān)系。

SAG2t具有較高的敏感性和特異性，不與親緣關(guān)系近的新孢子蟲(N.caninum)發(fā)生交叉反應(yīng)，并且能夠強(qiáng)烈刺激宿主的體液免疫產(chǎn)生較高的抗體水平，這為今后進(jìn)一步改良快速免疫色譜試驗(yàn)進(jìn)行弓形蟲感染的免疫診斷奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)抗重組蛋白抗體也可用于弓形蟲侵入宿主細(xì)胞的分子機(jī)制研究。另一方面將SAG2t蛋白與GST表達(dá)成融合蛋白，用親和層析的方式純化到可溶性蛋白質(zhì)，克服了產(chǎn)量少、難純化的缺點(diǎn)，為弓形蟲SAG2蛋白的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。綜上所述，本試驗(yàn)成功的克隆弓形蟲編碼的SAG2基因片段，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，重組蛋白質(zhì)具有良好的抗原性和免疫原性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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(編輯 白永平)

Prokaryotic Soluble Expression of Truncated SAG2 Protein of

Toxoplasmagondiiand Its Antigenic Activity ZHAO Dong-yue*，CHEN Jin-feng，WEI Jian-hui

(SouthernBiomedicalResearchCenteratFujianNormalUniversity，F(xiàn)uzhou350117，China)

To expressSAG2 gene ofToxoplasmagondiiby prokaryotic expression system and to identify its antigenicity，truncatedSAG2 without the highly hydrophobic signal peptide and C-terminus were amplified by PCR，and recombinant prokaryotic expression plasmid (pGEX-4T-3-SAG2t) with SAG2t protein gene was constructed.Then the recombinant plasmids were transferred intoE.coliDH5α，and the bacteria were induced by IPTG.The expression and immune-reactivity of SAG2t protein were detected by SDS-PAGE and Western blotting respectively.The yield of purified rSAG2t was more than 4 mg per liter of culture medium.Western blot showed that rSAG2t can be strongly recognized by mice serum infected withT.gondiiME49 strain and mice serum immunized by rSAG2t .The result showed that the soluble expression of SAG2t protein with favorable complete antigenic activity was implemented by prokaryotic expression system.

RH/ME49 strain ofToxoplasmagondii；Western blot；truncatedSAG2

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.018

2014-10-11

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金(WKJ-FJ-28)

趙東岳(1985-)，山東高青人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物病原與分子生物學(xué)研究，E-mail:296158826@qq.com

*通信作者：趙東岳，Tel：0591-22868832，E-mail：mountainous@163.com

S852.729

A

0366-6964(2015)12-2258-06