王廬宇，朱長軍

（天津師范大學生命科學學院，天津300387）

驅(qū)動蛋白Kif18A多克隆抗體的制備、純化及免疫特異性檢測

王廬宇，朱長軍

（天津師范大學生命科學學院，天津300387）

采用標簽蛋白誘導表達純化、蛋白質(zhì)譜、Western Blot、免疫熒光染色等多種分子生物學與細胞生物學方法，探究了一種制備蛋白特異性多克隆抗體、檢測抗體并且運用抗體獲得蛋白翻譯后修飾信息的實驗思路.結(jié)果表明，使用這種方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗體.得到的抗體血清可以很好地應用于Western Blot（蛋白免疫印跡）、Co－IP（免疫共沉淀）等分子生物學實驗.將抗體血清純化后可以應用于免疫熒光染色實驗，并可以獲得良好清晰的實驗結(jié)果.此外，利用制備出的Kif18A特異性抗體對細胞內(nèi)源性Kif18A進行Co－IP實驗后進行質(zhì)譜分析，得到了內(nèi)源性Kif18A蛋白翻譯后的修飾信息，為研究Kif18A蛋白的定位與功能奠定了良好的基礎.

驅(qū)動蛋白Kif18A；多克隆抗體；蛋白質(zhì)譜；蛋白磷酸化

在已知的40余種驅(qū)動蛋白（kinesin）分子中，Kif18A蛋白近年來受到了越來越多的關(guān)注.在先前的文獻中報道，Kif18A蛋白分子在體外實驗中證實具有微管解聚活性.這不同于早期報道中典型的驅(qū)動蛋白分子的特性.先前認為驅(qū)動蛋白家族分子中有些具有微管解聚酶功能（如Kif2C，即MCAK蛋白），有些可以沿細胞骨架運動（如Kif5A）.但是，像Kif18A蛋白這樣兩種功能兼具的分子還比較罕見［1］.近年來國際上關(guān)于該蛋白分子的文獻報道數(shù)量達到數(shù)十篇，其中最為引人關(guān)注的焦點在于Kif18A蛋白對于細胞分裂進程的正常進行以及紡錘體功能和形態(tài)的影響起到了至關(guān)重要的作用.尤其是Kif18A蛋白在有絲分裂前中期對于染色體正確排列的重要意義以及Kif18A與細胞紡錘體中期檢驗點的密切關(guān)系更是成了最近5年的研究熱點.此外，Kif18A蛋白在某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或遷移的過程中都發(fā)揮到了相應的作用［2－7］.為了能夠通過細胞內(nèi)或細胞外實驗對該蛋白分子進行深入的研究，必須要得到純度和效價都極高的特異性Kif18A蛋白抗體，為此，本文設計了制備Kif18A特異性抗體的實驗，以滿足實驗室對于該蛋白分子在細胞和分子生物學層面的研究需要.

1 實驗材料與方法

1.1材料

人宮頸癌細胞HeLa，本實驗室自存；pEGFP－Kif18A（C297）質(zhì)粒為本實驗室先前構(gòu)建；pGEX－KG載體、pET28a載體為本實驗室自存.感受態(tài)大腸桿菌（E.coli）復制菌株Top10、表達菌株BL21購自TransGen公司.DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI以及T4DNA連接酶購自Thermo公司；λ－HindⅢdigest DNA Marker購自TaKaRa公司.其他試劑為進口原裝、分裝或國產(chǎn)分析純.DNA測序工作委托金唯智公司進行，蛋白質(zhì)譜分析工作委托軍事醫(yī)學科學院國家生物醫(yī)學分析中心進行.

1.2 GST與His標簽融合蛋白表達質(zhì)粒的制備

驅(qū)動蛋白8家族分子靠近C端部分包含多個結(jié)合功能域且暴露在外，為了得到特異性Kif8A的抗體，實驗中設計采用Kif18A蛋白分子C端297個氨基酸的區(qū)段作為抗原，免疫后得到該蛋白分子的多克隆抗體.前期，本實驗室已制備出pEGFP－Kif18A（C297）的真核表達質(zhì)粒，本實驗使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI將該質(zhì)粒在37℃條件下雙酶切2h，同時將pGEX－KG載體質(zhì)粒與pET28a載體質(zhì)粒37℃條件下雙酶切2h.隨后在1%瓊脂糖（BIOWEST）凝膠中進行電泳，將酶切后的目的基因條帶切下，使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將目的基因進行回收.使用T4DNA連接酶在16℃條件下將目的基因與載體連接過夜，從而構(gòu)建出pGEX－KG－Kif18A（C297）（簡稱GST－KC297）與pET28a－Kif18A（C297）（簡稱His－KC297）質(zhì)粒，二者在原核表達體系中分別表達GST蛋白標簽融合蛋白或His標簽融合蛋白.

1.3 GST與His標簽融合蛋白的表達

將構(gòu)建得到的原核表達質(zhì)粒GST－KC297與His－KC297轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌復制菌種Top10，挑選陽性單克隆，37℃條件下200r／min培養(yǎng)過夜.使用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit（250）提純質(zhì)粒，通過酶切和DNA測序進行鑒定.將提純、鑒定后的原核表達質(zhì)粒GST－KC297與His－KC297轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌表達菌種BL21，利用IPTG誘導融合蛋白表達，離心收集細菌沉淀進行后續(xù)實驗.

1.4可溶性蛋白抗原的純化

使用L－buffer（5mg／mL Lysozyme，100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L β－ME）溶菌后使用T－buffer（2%Triton X－100，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，10mmol／L EDTA，1mmol／L EGTA，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL leupeptin）裂解細菌，隨后使用超聲破碎儀把細菌徹底裂解.將Glutathione Sepharose（GE）與細菌裂解液在4℃條件下充分搖勻12h，使細菌中表達的GST－KC297蛋白與Glutathione Sepharose珠子充分結(jié)合.隨后使用E－buffer（100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L GSH，20mmol／L β－ME）洗脫GST－KC297蛋白，并使用500～1 000倍洗脫液體積的PBS在4℃條件下透析12h，以除去E－buffer中的谷胱甘肽和洗脫液中其他的有毒成分.

1.5不可溶蛋白的純化與抗原－樹脂凝膠的制備

將實驗中細菌誘導表達的His－KC297采用SDS－buffer（含有2%SDS的PBS緩沖液）裂解，用與裂解液等體積的Triton buffer（含有8%Triton X－100的PBS緩沖液）中和，隨后與Ni－NTA Resin（BIO BASIC INC.）在室溫條件下充分混合搖勻4h，使His－KC297特異性地結(jié)合到樹脂珠子上.使用DMB將珠子與His－KC297蛋白進行共價交聯(lián)，并使用乙醇胺（0.2mol／L，pH＝8.0）中和，得到抗原－樹脂交聯(lián)珠子.

1.6抗體血清的純化

使用飽和（NH4）2SO4將血清中免疫球蛋白沉淀，利用1／3血清體積的TBS重懸沉淀的蛋白，隨后使用500倍重懸液體積的TBS在4℃條件下透析12h，以除去殘留的（NH4）2SO4.把透析后的免疫球蛋白（抗體主要為IgG）重懸液與先前實驗中得到的抗原（His－KC297）－樹脂（Ni－NTA）交聯(lián)珠子在4℃條件下充分結(jié)合，并采用甘氨酸溶液洗脫（0.1mol／L，pH＝2.5）.洗脫后與1／10洗脫液體積的Tris－Cl緩沖液（1mol／L，pH＝8.0）混合使抗體溶液呈中性，并貯存于4℃冰箱中.

1.7細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將人子宮頸癌細胞HeLa用含有10%胎牛血清（HyClone）的DMEM／High Glucose細胞培養(yǎng)基（HyClone）在37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗前在24孔板內(nèi)每孔接種30 000～50 000個細胞，接種24h后待細胞附著到皿壁或細胞爬片后進行質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染.細胞轉(zhuǎn)染實驗在500μL體系中進行，使用TurboFect（thermo scientific）作為轉(zhuǎn)染試劑.每500μL體系中使用1μLTurboFect，200ng質(zhì)粒；在免疫共沉淀（IP）實驗中使用直徑15cm的平皿培養(yǎng)細胞；在進行細胞周期同步化時，加入50nmol／L Taxol或80ng／mL Nocodazole，20h后收集細胞進行后續(xù)實驗.

1.8免疫熒光染色與免疫共沉淀

免疫熒光染色實驗采用福爾馬林固定液（含有3%甲醛，2%蔗糖的PBS緩沖液）固定15min，采用山羊血清封閉液（含有10%山羊血清，0.4%Triton X－100的PBS緩沖液）封閉0.5h.二抗為FITC或Texas Red標記的羊源二抗，采用DAPI染色DNA.一抗室溫孵育2h，二抗室溫避光孵育1h，DAPI室溫避光孵育3min.免疫共沉淀實驗采用NP－40buffer（1%NP－40，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL Leupeptin，2μg／mL Aprotinin，50mmol／L Na3VO4，5mmol／L NaF）冰浴裂解細胞1h，裂解后在4℃條件下14 000r／min離心10min；取上清加入Kif18A抗體血清后4℃條件下?lián)u勻4h，隨后加入Protein A－Agarose（Roche），4℃條件下?lián)u8h.隨后用NP－40buffer清洗3遍珠子，使用SDS sample buffer（2%SDS，50mmol／L pH＝6.8Tris－Cl，10%甘油，20%β－ME）裂解珠子上結(jié)合的蛋白.將裂解液進行蛋白電泳，電泳后進行考馬斯亮藍染色或進行Western Blot實驗.

2 實驗結(jié)果

2.1 GST－KC297與His－KC297原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

本實驗室在前期已經(jīng)構(gòu)建出以GFP為標簽的融合蛋白質(zhì)粒pEGFP－Kif18A（C297），該質(zhì)粒為在載體質(zhì)粒的GFP基因C端后插入了一個可表達Kif18A蛋白C端297個氨基酸殘基的Kif18A基因片段.在該質(zhì)粒的Kif18A（C297）基因片段的兩端存在限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI的酶切序列，故本實驗首先對于GFP－Kif18A（C297）質(zhì)粒進行了酶切鑒定和DNA測序鑒定.如圖1A所示，經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后確實得到了一個基因片段，同時DNA測序結(jié)果顯示，該質(zhì)粒確認無誤.將回收后的基因插入到本實驗室所有的帶有GST蛋白標簽基因的pGEX－KG載體質(zhì)粒中以及帶有8個His蛋白標簽基因的pET28a載體質(zhì)粒中.質(zhì)粒構(gòu)建后進行酶切鑒定（如圖1B所示）與DNA測序鑒定驗證.

2.2 GST－KC297抗原蛋白的純化

將誘導、表達GST－KC297蛋白的細菌沉淀，利用T－buffer裂解后溶菌產(chǎn)物的上清即可獲得大量的GST－KC297蛋白.將300mL細菌培養(yǎng)液離心收集后，裂解于30mL體系中，裂解后離心棄去沉淀，在上清液中取出10μL進行SDS－PAGE蛋白電泳，采用考馬斯亮藍R－250染色后（見圖2A），可見經(jīng)IPTG誘導后的GST－KC297蛋白的大量表達.使用1.4的方法純化GST蛋白后洗脫于2mL體系中，取出10μL洗脫液進行SDS－PAGE蛋白電泳，采用考馬斯亮藍－250染色（見圖2B）進行驗證.使用BCA法測量蛋白濃度后，－80℃保存.

2.3 His－KC297蛋白與Ni樹脂凝膠的交聯(lián)

采用本文1.5中的方法，在200mL體系中使用BL21菌株表達His－KC297蛋白，經(jīng)IPTG誘導表達后，使用SDS buffer裂解細菌.隨后加入1mL Ni樹脂凝膠珠子與His－KC297，使其充分結(jié)合并交聯(lián).實驗中可見經(jīng)DMB交聯(lián)后的抗原－凝膠復合體不可被SDS裂解，在全部SDS－PAGE過程中His－KC297蛋白也不能從凝膠珠子上分離下來.

2.4抗原的免疫與抗體純化

第一次抗原免疫使用1mL弗氏完全佐劑與100μg純化后的抗原蛋白（以PBS補至2mL），充分混勻后皮下注射免疫雄性新西蘭大白兔.隨后的3周每周對該大白兔進行一次抗原的注射（采用弗氏不完全佐劑）.從第4周開始經(jīng)兔耳緣靜脈抽取免疫后的血清10～15mL，將血液在4℃條件下靜置48h，14 000r／min離心后取上清，即為抗體血清.第5周繼續(xù)注射抗原加強免疫，以此類推，隔周注射抗原，隔周抽血，持續(xù)6個月.經(jīng)HeLa細胞Co－IP的實驗檢測可知，實驗從第4周開始（前4周未知）得到的免疫血清中相對免疫前血清在Western Blot中出現(xiàn)了比較明顯的特異性條帶（相對分子質(zhì)量為100 000附近）；隨后得到的幾次抗體血清中的信號強度不斷增加，到免疫第8周以后血清的抗體特異性逐漸穩(wěn)定并持續(xù)較高的效價約3個月.故本文中提及的Kif18A特異性免疫血清即為實驗中得到的第8周至第30周的抗體血清.將第8周至第30周的抗體血清合并后進行后續(xù)的抗體純化實驗.

2.5抗體血清與純化抗體的檢測

如圖3A所示，利用本實驗中獲得的Kif18A特異性免疫兔血清作為抗體，使用HeLa細胞全細胞裂解液進行Western Blot實驗，可見在相對分子質(zhì)量為100 000的位置附近有一條特異性免疫條帶.使用Kif18A特異性siRNA處理細胞20h后該特異性條帶消失，從而證實抗體血清確實對于Kif18A蛋白具有優(yōu)良的特異性.如圖3B所示，選取20mL Kif18A特異性抗體血清，使用1.7中的方法純化后，經(jīng)過1∶100倍比稀釋后使用正常培養(yǎng)的HeLa細胞進行免疫熒光染色實驗，綠色為微管染色、紅色為Kif18A、藍色為DNA.本實驗中的Kif18A染色定位與文獻中的報道完全一致.可以證實，該實驗中得到的抗體不僅可以進行蛋白免疫印跡實驗還可以進行免疫熒光染色實驗.

2.6驅(qū)動蛋白Kif18A的翻譯后蛋白修飾位點的檢測

在上述實驗中發(fā)現(xiàn)，正常傳代培養(yǎng)的HeLa細胞中Kif18A蛋白的表達豐度比較低.以前有研究報道，Kif18A分子在有絲分裂期大量表達，伴隨有絲分裂后期的到來，由于APC復合物的激活，Kif18A隨即大量降解［8］.故本文中的某些實驗采用了細胞周期同步化的方法以便獲得含有Kif18A分子較多的有絲分裂前、中期的細胞.但是細胞周期同步化處理以后，在進行Western Blot實驗時意外發(fā)現(xiàn)不僅Kif18A的條帶熒光信號大幅增強，伴隨而來的還有新條帶的產(chǎn)生（見圖4A），因此推測Kif18A分子可能在有絲分裂期大量表達后還出現(xiàn)了蛋白的翻譯后修飾現(xiàn)象（如脲甲基化、磷酸化、乙?；龋?故本實驗通過IP的方法將用Taxol同步化處理的Kif18A蛋白與抗體共沉淀后進行蛋白電泳.利用考馬斯亮藍（R－250）染色后，切下Kif18A蛋白的條帶，委托質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示Kif18A蛋白分子的確在許多區(qū)域都顯示有蛋白的表達后修飾現(xiàn)象發(fā)生（見圖4B），圖4B中列出了質(zhì)譜分值最高的15個蛋白修飾.

3 討論

通過本實驗中介紹的方法獲得的特異性Kif18A蛋白抗體血清與純化后的特異性Kif18A蛋白抗體在分子生物學以及細胞生物學實驗中都能比較好地發(fā)揮其功能.由于抗體血清在純化的過程中會伴隨著抗體效價的降低，但是為了獲得純度較高的抗體又必須將抗體血清中的雜質(zhì)去除.基于上述兩種考慮并結(jié)合實驗的實際情況，一般認為，抗體血清較為適合進行Western Blot等實驗.因為在SDS存在的體系中，蛋白分子的高級構(gòu)象已經(jīng)喪失，所以蛋白分子將暴露出比存在高級構(gòu)象的分子更多的免疫結(jié)合位點.在此情況下，雖然抗體血清的純化程度不高，但是也可以獲得非常好的免疫效果.相反，如利用純化的抗體進行Western Blot等實驗時，雖然抗體純化程度高，但是由于抗體效價的降低會造成抗體的過多浪費，同時也不會獲得好的實驗結(jié)果；在進行免疫熒光染色或免疫共沉淀實驗時，由于抗原蛋白分子還維持一定的高級構(gòu)象，導致抗原分子暴露出的免疫位點較少.所以，如若采用抗體血清進行免疫雜交，會導致實驗結(jié)果的背景升高，從而影響結(jié)果的清晰度.一般認為在進行該類實驗時采用純化后的抗體能夠得到較為清晰的實驗結(jié)果.

雖然本實驗中通過蛋白質(zhì)譜的方法檢測到了Kif18A存在多種蛋白修飾的可能性，但是主要的蛋白翻譯后修飾是哪一種，發(fā)生在哪個具體的氨基酸位點，尚有待深入研究.另外，在Kif18A發(fā)生蛋白修飾后其功能和定位會發(fā)生什么樣的改變也尚不清楚.并且，在統(tǒng)計質(zhì)譜分析結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，Kif18A的尾部（tail）區(qū)域存在大量的疑似蛋白修飾位點［9］.這與先前報道的驅(qū)動蛋白8家族成員（特別是Kip3與Kif18A）尾部區(qū)域存在重要功能的結(jié)果相符合［10］，也預示著Kif18A蛋白的尾部區(qū)域可能對于蛋白功能的發(fā)揮起到了非常重要的調(diào)控作用.

本文著重介紹了Kif18A蛋白分子的抗體制備與純化方法.實驗中得到的Kif18A特異性抗體在抗體檢測實驗中體現(xiàn)了較為優(yōu)良的品質(zhì)，為后續(xù)深入研究該蛋白分子打下了堅實的基礎；此外，本實驗中Kif18A蛋白修飾的發(fā)現(xiàn)與檢測對后續(xù)實驗也起到了重要的指導作用.

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Preparation，purification and specificity determination of kinesin－8family member Kif18Apolyclonal antibody

WANG Lu－yu，ZHU Chang－jun
（College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To investigate the post－translational modification of Kif18Aby mass spectrometry，first performed expriment to prepare antibody against Kif18Aby injection of purified GST－Kif18protein into rabbit.By using affinity purification with Ni－NTA Agarose beads from rabbit serum，we got purified antibody，which has good quality of application in wester blot and immuniprecipitation.Thus provides a good oppertunity to further investigate the fuction of post－translational modification of Kif18A.

Kif18A；polyclonal antibody；mass spectrometry；protein phosphorylation

Q 291 ［學科代碼］ 180·21 ［

］ A

（責任編輯：方林）

1000－1832（2015）01－0129－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.024

2013－11－24

國家自然科學基金面上項目（31271485）；國家自然科學基金青年基金資助項目（31301138）；2011年教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”資助項目（NCET－11－1066）；天津市應用基礎與前沿技術(shù)研究計劃重點項目（12JC2DJC21400）.

王廬宇（1987—），男，碩士研究生；通訊作者：朱長軍（1972—），男，博士，教授，主要從事細胞分子生物學研究.