豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展

索延樂(lè) 衛(wèi)春曉 李天麗 房大學(xué) 河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 459000

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是I 群冠狀病毒的成員。目前對(duì)于PEDV 感染機(jī)理方面的研究較少，2007年豬氨基肽酶(pAPN)被證實(shí)為PEDV 的功能性細(xì)胞感染受體，繼而又有研究從數(shù)量上證實(shí)增加pAPN 的密度可以增大PEDV 感染率。PEDV 基因組長(zhǎng)為27000～33000 個(gè)核苷酸(nt)，靠近3’端5kb 區(qū)域內(nèi)有5 個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(ORF)。編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白：S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白，位于E 基因上游的ORF 命名為ORF3，編碼一個(gè)未知功能且具有多態(tài)性的產(chǎn)物。

1 豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)

自然條件下，PEDV 通過(guò)口與鼻途徑進(jìn)入豬的體內(nèi)。首先侵犯小腸集合淋巴結(jié)區(qū)，接著進(jìn)入小腸黏膜上皮細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖，病毒由感染處向周圍廣泛擴(kuò)展，直到侵及全部小腸。PEDV 主要通過(guò)直接接觸、間接接觸、飼喂被病毒污染的飼料和飲水等途徑而進(jìn)行水平傳播。

PED 在世界范圍內(nèi)呈廣泛的流行，在亞洲豬場(chǎng)中的感染非常嚴(yán)重，各種年齡的豬都能感染發(fā)病，其死亡率也很高，尤其是哺乳仔豬。甘振磊等對(duì)2005～2007年豬的幾種病毒性腹瀉病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PED 的感染在我國(guó)豬病毒性腹瀉病中占主導(dǎo)地位。病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了適應(yīng)宿主及與宿主長(zhǎng)期共存亡的特殊分子機(jī)制。

2 豬流行性腹瀉病毒的細(xì)胞培養(yǎng)特性

自從上世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)PEDV 以來(lái)，研究者試圖嘗試采取各種方法使病毒適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)，但均未獲得成功，這在一定程度上制約了PEDV 的研究進(jìn)程。直到1988年Hofmann 等首次在培養(yǎng)基含胰酶的Vero 細(xì)胞上成功繁殖出PEDV，并認(rèn)為胰酶對(duì)PEDV 纖突糖蛋白切割作用增強(qiáng)了病毒對(duì)Vero 細(xì)胞的感染力，此方法在PEDV 分離細(xì)胞培養(yǎng)和疫苗的研究中被廣泛應(yīng)用。此后，許多研究者對(duì)PEDV 在不同細(xì)胞系中的培養(yǎng)進(jìn)行了深入研究。

目前，Vero 細(xì)胞是分離培養(yǎng)PEDV 的較為理想的細(xì)胞系，但Vero 細(xì)胞來(lái)源的不同、培養(yǎng)體系、條件的差異及毒株特性的不同對(duì)PEDV 的分離有著至關(guān)重要的影響。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)PEDV 在Vero 細(xì)胞上的培養(yǎng)特性進(jìn)行深入的研究。Hofmann 等的試驗(yàn)表明，對(duì)比加胰酶培養(yǎng)PEDV 時(shí)，不加胰酶的病毒毒力會(huì)大大減弱，如此連續(xù)培養(yǎng)幾代后，引起病毒在細(xì)胞上丟失。而錢(qián)永清等通過(guò)帶毒傳代法傳至第5 代以后，在培養(yǎng)液中逐步減少胰酶，直到不加胰酶，結(jié)果培育成一株不依賴胰酶的PEDV。李樹(shù)根等將接種病料的Veto細(xì)胞單層通過(guò)改變加入胰酶量發(fā)現(xiàn)，加入含10、20、30 和60μg/mL 胰酶量的細(xì)胞維持液培養(yǎng)18～20h，均出現(xiàn)細(xì)胞病變，且含60μg/mL 胰酶量的細(xì)胞維持液的Vero 細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞病變最明顯，可達(dá)60%。適應(yīng)含胰酶的Vero 細(xì)胞中傳12 代后，逐漸轉(zhuǎn)入不含胰酶的Vero 細(xì)胞中傳代，可連續(xù)傳19 代。

3 抗病毒天然免疫

目前普遍認(rèn)為，冠狀病毒通過(guò)編碼特定蛋白來(lái)逃逸或抑制宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。PEDV 侵入細(xì)胞后，其正義單鏈基因組RNA 立即被釋放入細(xì)胞質(zhì)，翻譯產(chǎn)生2 個(gè)多聚蛋白：PP1a 和PP1ab。PP1a的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp3 編碼2 個(gè)木瓜樣蛋白酶PLP1和PLP2 結(jié)構(gòu)域。張百靈等研究發(fā)現(xiàn)，PLP1 對(duì)干擾素?zé)o拮抗作用，而PLP2 是PEDV 編碼的一種干擾素拮抗劑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDV PLP2 與抗病毒天然免疫通路中的受體-維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)和重要調(diào)節(jié)蛋白-干擾素基因刺激子(STING)發(fā)生相互作用，并對(duì)RIG-I 和STING 具有明顯的去泛素化酶(DUB)活性，進(jìn)而發(fā)揮其抑制宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)的作用。

天然免疫信號(hào)通路中重要分子和蛋白的泛素化及去泛素化修飾在天然免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。張百靈等證實(shí)，PEDV 感染細(xì)胞后不誘導(dǎo)IFN-β 產(chǎn)生，并且負(fù)調(diào)節(jié)Po1y(I：C)激活的IFN-β表達(dá)通路。由于IFN 轉(zhuǎn)錄需要活化轉(zhuǎn)錄因子NFκβ、IRF3 和AP-1 等，且最新研究發(fā)現(xiàn)，PEDV 能夠抑制IRF3 的活化，據(jù)此研究人員推測(cè)PEDV 可能是通過(guò)抑制IRF3 的活化從而負(fù)調(diào)節(jié)IFN-β表達(dá)通路。

4 功能性受體

PEDV 主要利用其S 蛋白與豬腸道細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過(guò)膜融合侵入細(xì)胞內(nèi)，集中在豬小腸絨毛上皮細(xì)胞中復(fù)制，新生病毒通過(guò)糞便和嘔吐物排出體外。PEDV 屬于冠狀病毒群，同群的豬傳染性胃腸炎病、貓傳染性腹膜炎病毒、人呼吸道冠狀病毒229E 的細(xì)胞受體都是其宿主的氨基肽酶N（APN）。研究表明，豬可溶性APN 在體外能提高仔豬抗PEDV 抗體水平和促進(jìn)PEDV 在Vero 細(xì)胞中增殖，這揭示了豬APN 對(duì)PEDV 的感染性和復(fù)制起重要作用。Eeuri 等發(fā)現(xiàn)，氨肽酶N 的密度與PEDV 感染有關(guān)系對(duì)pAPN表達(dá)少的ST 細(xì)胞表面表達(dá)pAPN，發(fā)現(xiàn)熒光檢測(cè)后，表面表達(dá)量增多的ST 細(xì)胞可以很好地被病毒感染。Hyun-M 等發(fā)現(xiàn)，有除豬氨肽酶以外的潛在功能性受體二肽基肽酶4。

5 討論

豬流行性腹瀉現(xiàn)在豬場(chǎng)中遲遲得不到控制，主要有以下原因。現(xiàn)場(chǎng)診斷困難，缺乏有效的疫苗，免疫監(jiān)測(cè)比較困難，易在豬場(chǎng)中循環(huán)傳播。目前，抗PEDV 的免疫機(jī)制不是十分清楚，預(yù)防PED 廣泛應(yīng)用的免疫方法是對(duì)懷孕母豬進(jìn)行免疫接種，然后通過(guò)母源抗體使仔豬獲得人工被動(dòng)免疫保護(hù)。由于PEDV 具有腸道組織嗜性的特點(diǎn)，在抗PEDV 感染免疫過(guò)程中除體液免疫和細(xì)胞免疫外，局部腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用，我國(guó)研制的TGE和PED 系列疫苗采用了豬后海穴免疫接種，此免疫接種途徑除激活體液免疫和細(xì)胞免疫外，還激活了腸道局部黏膜免疫，所以與常規(guī)免疫接種途徑相比具有更好的效果。PEDV 的研究目前還處于起步階段，良好的飼養(yǎng)管理也是必須的防控步驟，減少PED 的發(fā)生是控制生產(chǎn)上仔豬病死率的首要工作。