馮洋洋,陳章寶

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400715;2.西安思源學(xué)院護(hù)理學(xué)院,陜西 西安 710038)

胰酶是從哺乳動(dòng)物的胰腺中提取并分離得到的一種混合酶,由多種酶組成,主要包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等消化酶[1]。胰蛋白酶可促進(jìn)人體蛋白質(zhì)分解,胰淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化成麥芽糖等二糖,胰脂肪酶具有幫助消化人體脂肪的能力[2]。因此,胰酶在臨床應(yīng)用中占據(jù)一定地位。胰酶存在自身的缺點(diǎn),酸性條件下,胰脂肪酶會(huì)很快失去活性,中性和堿性條件下,則保持較高活性[3]。為此,要求胰酶制劑應(yīng)具備耐酸的能力,同時(shí)保證在腸道中必須有較高釋放度的特性,從而達(dá)到助消化作用。目前,關(guān)于胰酶制劑上市的產(chǎn)品有多酶片、胰酶腸溶片劑和膠囊劑[2]。多酶片硬度大,口服之后很難分解成小顆粒,不能與食糜同步進(jìn)入十二指腸,導(dǎo)致胰酶中胰脂肪酶的穩(wěn)定性差,活性降低[4];胰酶腸溶片針對有吞服困難的患者不適合[2];胰酶腸溶膠囊里面的內(nèi)容物為胰酶腸溶微丸,在胃中釋放出分散體系的胰酶腸溶微丸,到達(dá)小腸后快速釋放胰酶發(fā)揮作用[5]。微丸粒徑小,屬于多元體系,有缺陷的個(gè)別微丸不會(huì)影響整體藥物釋放特性,藥物的穩(wěn)定性得到保證[6]。另外,它屬于分散體系,在胃腸道分布面積較大,刺激性小,提高了藥物的安全性[7]。關(guān)于胰酶制劑的活性和含量評價(jià)指標(biāo),胰脂肪酶起著決定性作用[8]。因此,在評價(jià)市售胰酶制劑時(shí),通常選擇以胰脂肪酶的活性和含量作為關(guān)鍵指標(biāo)[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JBZ-300離心式包衣制粒機(jī)(中國遼寧.醫(yī)藥新藥技術(shù)研究所);D-800LS藥物溶出儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司);TG16-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);UV-2700紫外分光光度計(jì) (日本島津);sartoriUs普及型pH計(jì)(PB-10)(賽多利斯);680酶標(biāo)儀(美國伯樂);DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

胰酶(武漢三恒醫(yī)藥化工有限公司,胰蛋白酶活力≥1800U/g,胰淀粉酶活力≥21000U/g,胰脂肪酶活力≥12000U/g);胃蛋白酶(1:3000,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);微晶纖維素(MCC)(上海風(fēng)泓藥用輔料技術(shù)有限公司);交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCNa)(上海風(fēng)泓藥用輔料技術(shù)有限公司);羥丙基甲基纖維素(HPMC)(安徽山河藥用輔料股份有限公司);滑石粉(成都市科龍化工試劑廠);檸檬酸三乙酯(東京化成工業(yè)株式會(huì)社);EUdragit L30D -55(德固賽);鹽酸、硫酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人工胃液對胰酶活力的影響

依據(jù)《中國藥典》2015年版·二部中胰酶[6]項(xiàng)下關(guān)于活力的測定方法,稱取適量的胰酶粉3份,分別與人工胃液作用0.5 小時(shí)、1 小時(shí)、2 小時(shí)、3 小時(shí)、4 小時(shí)后,分別測定胰脂肪酶、胰蛋白酶和胰淀粉酶活力[10],觀察人工胃液對三種酶活力的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 人工胃液對胰酶活力的影響

從圖1可知,在4小時(shí)內(nèi),胰蛋白酶活力始終保持在0左右,說明活力很低;胰淀粉酶活力基本保持不變,約為20U/mg,人工胃液對胰淀粉酶活力無影響;胰脂肪酶在30分鐘時(shí),活力由17U/mg變?yōu)?,完全失去活性,說明胰脂肪酶活力相對較高,但是不耐酸,需要抗酸保護(hù),這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)中采用胰脂肪酶活力表示胰酶腸溶制劑的溶出度結(jié)果相一致。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用胰脂肪酶活力表示胰酶腸溶微丸中胰酶的溶出度。

2.2 載藥微丸處方

根據(jù)文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處方。以微丸是否成實(shí)心球型及微丸在18～24目(0.8～1.2mm)之間的收率為依據(jù),確定處方。

處方1:MCC∶CCNA∶HPMC:胰酶=8:2∶0.5∶4.5

處方2:甘露醇∶交聯(lián)聚維酮∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

處方3:甘露醇∶CCNA∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

處方4:MCC∶交聯(lián)聚維酮∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

結(jié)果表明:處方1和處方4可以成丸,微丸硬度較好,收率分別為85%和69%;處方2和處方4都難以成丸,因此考慮選用處方1用 來制備微丸。

2.3 載藥微丸制備工藝

2.3.1 制備工藝流程

將處方中涉及到的胰酶粉、MCC、HPMC、CCNA等輔料分別過100目篩,隨后分別稱取處方比例用量,混合均勻,加適量水制成具有一定可塑性的軟材(手握成團(tuán)、手松即散)[2],立即投入到擠壓機(jī)中,經(jīng)1.0毫米孔徑篩板擠成細(xì)條狀,迅速分批次加入到滾圓機(jī)內(nèi)進(jìn)行制粒和滾圓工藝,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速、滾圓時(shí)間等因素,待顆粒完全滾圓時(shí)停止操作,取出制備的微丸放置于40℃烘箱中干燥20h,整粒后,即得胰酶微丸。

2.3.2 微丸評價(jià)指標(biāo)

① 圓整度:將1.0 g胰酶微丸置一平板上,平板一側(cè)緩慢抬起,測量并記錄微丸滾動(dòng)前傾斜平面與水平所夾的角(Φ),Φ值越小,說明胰酶微丸流動(dòng)性越好,圓整度越好。

② 收率:通過18～24目(0.8～1.2mm)篩孔的胰酶微丸質(zhì)量記為m1,總投入量記為m,收率=m1/m*100%,收率越大越好[2]。

2.3.3 工藝條件優(yōu)化

3個(gè)制備工藝影響因素,即軟材擠出轉(zhuǎn)速(A)、微丸滾圓轉(zhuǎn)速(B)和時(shí)間(C),采用 L9(34) 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件(見表1),用圓整度和收率兩個(gè)指標(biāo)來評價(jià)工藝質(zhì)量,要求收率(y1)值越大越好,圓整度(y2)越小越好,綜合評分采用y=y1-y2表示,y值越大,代表相應(yīng)的工藝條件越好,結(jié)果見表 2和表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2和表3可知,影響胰酶微丸制備工藝因素大小的順序依次是B>C>A,B、C因素為顯著因素,擠出速度:924rpm>812rpm>700rpm,滾圓速度:504rpm>560rpm>616rpm;滾圓時(shí)間:8min>2min>5min,故最佳工藝為A3B1C3。

2.3.4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照上述確定的胰酶微丸制備最佳工藝參數(shù),同步制備3批小試試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明制備工藝參數(shù)可靠,具體見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.4 載藥微丸的包衣

2.4.1 腸溶層包衣液的配置

取Eudragit L30D-55聚合物水分散體適量,用純化水稀釋至聚合物濃度為15%,攪拌均勻,備用。用純化水制備濃度12%的檸檬酸三乙酯混懸液,備用。將后者緩慢倒入前者溶液,加水稀釋至聚合物濃度為7.5 %,緩慢攪拌30min后,過80目篩網(wǎng),濾液即腸溶層包衣液。

2.4.2 包衣工藝流程

采用離心式包衣制粒機(jī)進(jìn)行包腸衣。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,向包衣鍋中加入適量整粒后的胰酶微丸,用濃度為1% HPMC混懸液包隔離層,包衣過程動(dòng)態(tài)加入適量滑石粉。當(dāng)隔離層厚度約為10%時(shí),停止包衣,并取出包隔離層后的胰酶微丸于40℃烘箱中干燥約10min,隨后,將干燥過的包有隔離層的胰酶微丸再用腸溶層包衣液包衣,當(dāng)腸衣層達(dá)到一定厚度,停止包衣,取出胰酶腸溶微丸,并于40℃烘箱干燥2h,即得。

2.4.3 腸溶層包衣液處方單因素考察

包衣增重對胰酶累計(jì)釋放度影響:分別稱取5份120g包有隔離層的胰酶微丸置于離心式包衣制粒機(jī)的包衣鍋內(nèi)進(jìn)行包衣,包衣增重分別設(shè)置為25%、30%、35%、40%、45%,固其他條件不變,滑石粉適量,制備胰酶腸溶微丸,備用。選取《中國藥典》2015版·四部通則0931溶出度與釋放測定法的第二法,測定胰酶腸溶微丸的體外釋放度;采用《中國藥典》2015版·二部中胰酶項(xiàng)下的活力測定方法,測定不同包衣增重后胰酶腸溶微丸中胰脂肪酶活力,用活力來計(jì)算胰酶累計(jì)釋放度,見圖2。

圖2 包衣增重對胰酶釋放度的影響

由圖2可知,腸溶層包衣增重?cái)?shù)值為25%時(shí),胰酶在人工胃液中累計(jì)釋放量>10%,不符合要求;包衣增重為40%和45%時(shí),胰酶在人工腸液中累計(jì)釋放量﹤70%,不符合要求;包衣增重為30%和35%時(shí),胰酶累計(jì)釋放度滿足要求,考慮到成本和工藝,包衣增重定為30%。

增塑劑用量對胰酶累計(jì)釋放度影響:配制檸檬酸三乙酯用量分別為12%、16%和20%的腸溶層包衣液進(jìn)行包衣,保持其他條件不變,按照2.4.3.1項(xiàng)下方法分別測定不同增塑劑用量的胰酶腸溶微丸中胰酶累計(jì)釋放度,見圖3。

圖3 不同增塑劑用量對胰酶累計(jì)釋放度的影響

由圖3可知,3種濃度的增塑劑都滿足條件,考慮到成本,故選擇增塑劑的用量為12%。

聚合物濃度對胰酶釋放度影響:配制聚合物濃度分別為5%,7.5%,10%,在其它條件不變情況下進(jìn)行包衣。按照2.4.3.1項(xiàng)下方法分別測定不同聚合物濃度的胰酶腸溶微丸中胰酶累計(jì)釋放度,見圖4。

圖4 聚合物濃度對溶出度的影響

由圖4可知,聚合物濃度為5%時(shí),胰酶在人工胃液中累計(jì)釋放度>10%,不符合要求;聚合物濃度為10%時(shí),包衣液粘度大,包衣時(shí)微丸容易粘連在一起難以分開,進(jìn)而影響腸溶衣的成膜性,導(dǎo)致不成膜且多孔,藥物釋放速度加快;聚合物濃度為7.5%時(shí)滿足要求,故選用聚合物濃度為7.5%。

腸溶層包衣液處方和工藝確定:通過腸溶層包衣液處方中各單因素考察,最后確定包衣處方和工藝為:聚合物濃度為7.5%,包衣增重為30%;檸檬酸三乙酯用量為12%;滑石粉適量。

處方和工藝驗(yàn)證試驗(yàn):按上述腸溶層包衣液處方和工藝制備3批胰酶腸溶微丸,進(jìn)行累計(jì)釋放度測定,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,3批胰酶腸溶微丸的釋藥速度無顯著性差異,說明制備處方和工藝重現(xiàn)性良好。

表5 三批樣品累計(jì)釋放度測定

2.5 不同指標(biāo)下的釋放度考察

取140729批次的胰酶腸溶微丸,按照測定方法,用BCA蛋白濃度試劑盒、胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活力來計(jì)算累計(jì)釋放度[2],見圖5。

圖5 不同的方法表示胰酶腸溶微丸中胰酶的累計(jì)釋放度

由圖5可知,用BCA蛋白濃度法表示胰酶腸溶微丸累計(jì)釋放度時(shí),數(shù)值要比胰脂肪酶活力表示的高一些,可能是制備過程中,機(jī)器產(chǎn)熱引起少量胰酶失活所致。胰蛋白酶活力太小,沒參考價(jià)值;胰脂肪酶活力和胰淀粉酶活力表示的溶出度基本一致,說明胰酶腸溶微丸中胰脂肪酶得到了抗酸保護(hù)。

3 討論

為避免胰脂肪酶在胃酸中失去活性,保證胰酶在腸道中釋藥的目的,本實(shí)驗(yàn)選用Eudragit L30D-55聚合物水分散體作為腸衣材料使用[10]。該腸衣材料顯酸性(pH值約為4),直接對胰酶微丸進(jìn)行包衣時(shí),會(huì)使部分胰脂肪酶活力失去,因此考慮在包腸衣之前,先對胰酶微丸進(jìn)行包隔離層。HPMC是最常用的隔離衣材料,顯中性,對胰酶活性無影響,與廉價(jià)的滑石粉配合使用,提高了包衣效率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,制得外觀良好的胰酶微丸收率在90%左右,再進(jìn)一步用含有滑石粉的HPMC混懸液進(jìn)行包隔離液衣,當(dāng)隔離衣厚度為10%時(shí),有效地防止了腸衣對胰酶活力的破壞,最后用Eudragit L30 D-55聚合物水分散體包腸衣時(shí),當(dāng)腸衣增重為30%時(shí),防止了胰酶腸溶微丸在胃中破壞,同時(shí)滿足了在腸中迅速釋放的要求,提高了胰酶腸溶微丸的穩(wěn)定性,保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。

由于胰脂肪酶活力會(huì)受到胃酸的影響會(huì)失活,選用胰脂肪酶活力來計(jì)算胰酶腸溶微丸中胰酶的累計(jì)釋放度,能更好地驗(yàn)證腸溶制劑制備是否成功。此外,本實(shí)驗(yàn)選用了BCA蛋白濃度法測定胰酶腸溶微丸中蛋白含量,可以判斷胰酶腸溶微丸在制備過程中是否失活,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用離心式包衣制粒機(jī)在制備胰酶腸溶微丸時(shí),胰酶有極少部分失活。原因是利用擠出滾圓制備微丸過程中,擠出篩孔與轉(zhuǎn)筒之間摩擦產(chǎn)熱,使得胰酶有一小部分失活,在后期工業(yè)化生產(chǎn)過程中,對機(jī)器工作產(chǎn)生的熱量要及時(shí)排除,可以考慮進(jìn)一步安裝降溫裝置。