張小蘭

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

PK15 細(xì)胞（Porcine Kidney Eplithelial cells），也稱PK15或PK（15）。來源于豬腎，中文名為豬腎上皮細(xì)胞，父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細(xì)胞 PK-2a，被 ATCC 收藏（CCL-33）[1]。 PK15細(xì)胞對豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒等多種病毒比較敏感，已廣泛應(yīng)用于獸用疫苗的研究和生產(chǎn)[2]。PK15細(xì)胞是已經(jīng)癌變了的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的生長和增殖能力，正常情況下可以無限地傳代[3]。但在實(shí)際培養(yǎng)中，細(xì)胞常常會出現(xiàn)不穩(wěn)定的生長情況，反復(fù)傳代后，隨著傳代次數(shù)的增多，可能出現(xiàn)細(xì)胞慢慢表現(xiàn)為生長不良、細(xì)胞變老、狀態(tài)變差直至不能繼續(xù)傳代等情況。在實(shí)際生產(chǎn)傳代中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞消化是影響細(xì)胞生長狀態(tài)好壞的關(guān)健因素之一。胰蛋白酶是細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代過程中經(jīng)常用到的水解酶[4]，其通過在特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞間結(jié)合處蛋白降解，這時細(xì)胞在自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力作用下成為球形，從而使細(xì)胞分開。不同組織或細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣，且胰酶分散細(xì)胞的活性與其種類、濃度、溫度和作用時間、消化程度、消化液殘留量等都有關(guān)。所以，為了給生產(chǎn)疫苗提供更好細(xì)胞狀態(tài)的PK15細(xì)胞，提高疫苗質(zhì)量，本試驗(yàn)通過對比胰酶A與胰酶B的消化效果及對細(xì)胞的影響，目的在于尋找一種對細(xì)胞更溫和、損傷更小的消化液，為生產(chǎn)疫苗提供優(yōu)良狀態(tài)的細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 PK15細(xì)胞株，大北農(nóng)集團(tuán)北京動物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 MEM購自gibco公司。

1.3 細(xì)胞消化液 0.25%胰酶A與0.25%胰酶B均購自某公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞制備 取一瓶處于對數(shù)生長期、細(xì)胞狀態(tài)良好的PK15細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，按一定的分種比例分出8瓶等量的T75細(xì)胞。隨機(jī)分為a、b、c、d四組，每組2瓶T75細(xì)胞。

1.4.2 細(xì)胞消化 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，使用胰酶A對a、b組細(xì)胞進(jìn)行消化，即棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱處理的PBS清洗細(xì)胞兩遍，每遍25 mL，再用胰酶A 4 mL消化細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)圓縮分離時，a組細(xì)胞消化完棄去消化液，加6 mL含5%血清的營養(yǎng)液終止消化并進(jìn)行吹打細(xì)胞，分種后進(jìn)行培養(yǎng)，b組細(xì)胞消化后不棄去消化液直接加入營養(yǎng)液終止消化，分種后進(jìn)行培養(yǎng)。使用胰酶B對c、d組細(xì)胞進(jìn)行消化即棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱處理的PBS清洗細(xì)胞兩遍，每遍25 mL，再用胰酶B 4 mL消化細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)圓縮分離時，c組細(xì)胞消化完棄去消化液，加6 mL含5%血清的營養(yǎng)液終止消化并進(jìn)行吹打細(xì)胞，分種后進(jìn)行培養(yǎng)，d組細(xì)胞消化后不棄去消化液直接加入營養(yǎng)液終止消化，分種后進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3 觀察記錄 記錄各組細(xì)胞消化終止時間、細(xì)胞分散效果，以及培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時細(xì)胞的生長狀態(tài)等。

2 結(jié) 果

2.1 胰酶A與B對細(xì)胞消化的影響 胰酶A的消化終止時間為5～6 min，胰酶B的消化終止時間為1～2 min，消化終止時間上相差較大。細(xì)胞消化后，胰酶A的分散效果均較好，呈大部分幾個細(xì)胞狀態(tài)，24 h細(xì)胞分裂也明顯，細(xì)胞狀態(tài)較好。胰酶B消化細(xì)胞，消化液棄去的細(xì)胞消化后基本處于單個狀態(tài)，24 h細(xì)胞分裂也明顯；但消化液不棄的團(tuán)塊較大，24 h生長不均勻，細(xì)胞分裂不明顯，細(xì)胞生長較慢。見表1。

2.2 胰酶A與B對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響 使用胰酶A消化PK15細(xì)胞，無論消化液棄去還是不棄去，細(xì)胞生長情況與細(xì)胞狀態(tài)都較理想。使用胰酶B消化細(xì)胞時，消化液棄去，細(xì)胞生長狀態(tài)好，與胰酶A差異不明顯；而消化液不棄去，細(xì)胞狀態(tài)變差、生長變緩慢，到72 h時，細(xì)胞才長到約80%密度，細(xì)胞有圓縮脫落現(xiàn)象。見表2。

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)結(jié)果表明，使用0.25%胰酶A消化PK15細(xì)胞，無論消化液是否棄去，消化終止時間較0.25%胰酶B更長，細(xì)胞分散效果均處于幾個細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞生長狀態(tài)好。使用0.25%胰酶B消化PK15細(xì)胞，當(dāng)消化液棄去時，細(xì)胞分散情況與細(xì)胞生長狀態(tài)都較好；而消化液不棄時，細(xì)胞消化后團(tuán)塊大，生長變緩慢、狀態(tài)變差，這應(yīng)該與胰酶B對細(xì)胞的毒性有關(guān)，當(dāng)胰酶殘留量大時，對細(xì)胞有一定的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差、生長緩慢。而胰酶A比較溫和，即使有殘留，對細(xì)胞損傷不大，細(xì)胞仍能穩(wěn)定生長。所以，0.25%胰酶A較0.25%胰酶B溫和，消化液棄去與否，細(xì)胞的消化與生長都理想。

2）胰酶B為動物源性的消化酶，而胰酶A是利用微生物生產(chǎn)的一種比較溫和的非動物源性消化酶，其動力學(xué)性質(zhì)和裂解特異性均與胰酶B類似[5]。但胰酶A純度更高，室溫保存穩(wěn)定性高，對細(xì)胞損傷更小。本試驗(yàn)使用0.25%胰酶A、0.25%胰酶B消化PK15細(xì)胞，通過對比了解兩種胰酶對PK15細(xì)胞消化和生長的影響，為實(shí)際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

表1 胰酶A與B對細(xì)胞消化的影響

表2 胰酶A與B對細(xì)胞生長的影響

[1]周利鋒.V1-2滅活疫苗生產(chǎn)用PK15細(xì)胞庫和PCV1-2種毒庫的建立及鑒定[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2011.

[2]魏園園,馬忠仁,王家敏,等.PK15細(xì)胞的生物學(xué)特性和質(zhì)量評價研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(5):61-65.

[3]陸有飛,高永銳.不同濃度胰蛋白酶對PK15細(xì)胞傳代消化的影響[J].廣西畜牧獸醫(yī),2004,20(2):56-57.

[4]靳輝,楊蓬勃,馮改豐,等.胰蛋白酶消化強(qiáng)度優(yōu)化獲得高純度體外的星形膠質(zhì)細(xì)胞[J].生理學(xué)報(bào),2015,67(1):103-109.

[5]周新華,張?jiān)谲?于沛.大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的改良及一種體外缺氧缺糖簡易模型的建立 [J].中南藥學(xué),2014,12(5):439-442.