王佳，鄭培和，許世泉，劉敏，王英平※

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118； 2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；3．吉林省標(biāo)準(zhǔn)研究院，長春 130022)

人參(PanaxginsengC.A.Mey.)和西洋參(PanaxquinquefoliumL.)同屬于五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物，根部入藥，是2種名貴的中藥材，已被廣泛應(yīng)用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，兩者中均含有三萜類皂苷成分，同時也是兩者藥理活性的主要活性物質(zhì)[1]。齊墩果酸型皂苷作為人參皂苷中的一類重要組成成分，具有抗腫瘤、降血糖、保肝、抗菌以及提高免疫等藥理活性[2～6]。本試驗(yàn)通過對人參和西洋參不同部位中齊墩果酸型皂苷的鑒定以及人參皂苷Ro的含量測定，觀察齊墩果酸型皂苷在二者不同組織中的分布狀況，為人參和西洋參中齊墩果酸型皂苷的研究及開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1200-6310高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、DAD檢測器(Agilent公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HC-2514高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

對照品人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Iva、姜狀三七皂苷R1(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈有限公司)；乙酸銨、氨水(色譜純，Sigma公司)；其它試劑均為分析純。

人參(吉林省集安市板岔村，6年生)、西洋參(吉林省撫松縣，4年生)，經(jīng)許世泉副研究員鑒定分別為五加科人參屬人參和西洋參。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18(4.6mm×250mm，5μm)。流動相：2.5mmol/L乙酸銨(w/v)和0.05‰氨水(v/v)水溶液(A)-乙腈(C)。梯度洗脫：0min～4min，17.5% C；4min～9min，17.5%～28.9% C；9min～19min，28.9%～40% C；19min～24min，40% C；24min～34min，40%～53.3% C；34min～44min，53.3%～56.6% C；44min～54min，56.6%～95% C；30min～35min，95% C。流速：1mL/min。柱溫：35℃。檢測波長：203nm。進(jìn)樣體積：10μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，采用負(fù)離子模式；干燥氣流速：8L/min；霧化氣溫度：350℃；氣簾氣：35psi；化合物穩(wěn)定性：100%；離子阱目標(biāo)離子：m/z 900；掃描范圍：m/z 150～1500；離子阱累積目標(biāo)離子：30 000；采集時間：50ms；自動二級質(zhì)譜；自動優(yōu)化碰撞能量范圍：1.0V的30%～200%；碰撞時間：20ms。

2.3 樣品制備及檢測

2.3.1對照品溶液制備精密稱取人參皂苷Ro對照品10.43mg，置于10mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解后定容至刻度，配制成1mg/mL的對照品原液。另取對照品人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Iva、姜狀三七皂苷R1適量，甲醇溶解，配制成混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液制備人參和西洋參4株，去泥土后分成根、莖、葉3部分，經(jīng)50℃鼓風(fēng)干燥后粉碎。各取樣品細(xì)粉0.5g，置于50mL容量瓶中，甲醇定容至50mL，浸泡過夜。次日超聲處理30min，放置室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取1mL置于1.5mL離心管內(nèi)，4000r/min，離心10min，上清液0.22μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 齊墩果酸型皂苷鑒定

3.1.1對照品質(zhì)譜分析取適量對照品混合液，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行質(zhì)譜分析。其中，峰1為人參皂苷Ro(tR=17.6min)，峰2為竹節(jié)參皂苷Iva(tR=19.5min)，峰3為姜狀三七皂苷R1(tR=23.7min)(圖1A)。為進(jìn)一步研究齊墩果酸型皂苷在負(fù)離子模式下的裂解行為，以人參皂苷Ro為例對其質(zhì)譜裂解進(jìn)行分析，并闡述該類型三萜皂苷化合物的裂解規(guī)律。

3.1.2人參皂苷Ro的MS/MS分析人參皂苷Ro在負(fù)離子模式下的母離子峰m/z 955[M-H]-。對分子離子峰進(jìn)行MS裂解分析，其中，豐度最高的碎片離子m/z 793對應(yīng)[M-H-Glc]-，m/z 613對應(yīng)[M-H-2Glc-H2O]-，m/z 455對應(yīng)[M-H-2Glc-GlcA]-，即脫去取代基上全部糖苷，為齊墩果酸。此外，還得到豐度較弱的碎片離子m/z 835、m/z 731、m/z 523，分別對應(yīng)[M-H-120]-、[M-H-Glc-62]-、[M-H-2Glc-108]-，這與孟青等研究結(jié)果一致[7]。通過對人參皂苷Ro質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行分析，齊墩果酸型皂苷在負(fù)離子模式下較容易獲得母離子[M-H]-。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析，C-3和C-28分別連有羥基和羧基，該類化合的C-3和C-28的糖苷鍵容易首先發(fā)生裂解，產(chǎn)生子離子碎片，并最終獲得穩(wěn)定的苷元碎片離子，即齊墩果酸。因此，將m/z 455作為該類化合物的特征碎片離子(圖1B)。

3.1.3化合物1、化合物2、化合物3的鑒定負(fù)離子模式下，通過對化合物1、化合物2和化合物3質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行分析，同時參考對照品的保留時間，得出3種化合物分別為人參皂苷Ro(1)、竹節(jié)參皂苷Iva(2)和姜狀三七皂苷R1(3)。

3.1.4化合物4、化合物5的鑒定化合物4的保留時間為17.3min，負(fù)離子模式下的母離子m/z 1087，判斷其分子量為1088；對子離子碎片進(jìn)行分析，m/z 955、m/z 925、m/z 745和m/z 569 ，分別對應(yīng)[M-H-Ara]-、[M-H-Glc]-、[M-H-2Glc-H2O]-、[M-H-2Glc-Ara-H2O-CO2]-。且齊墩果酸特征碎片離子m/z 455對應(yīng)[M-H-GlcA-2Glc-Ara]-。由此推斷化合物4是C-3和C-28位連有2個六碳糖、1個六碳糖酸和1個五碳糖的齊墩果酸型皂苷。根據(jù)文獻(xiàn)，推斷化合物4為Stipulenaoside R2[8](圖1C)。

化合物5的保留時間為17.9min，負(fù)離子模式下的母離子峰m/z 1087[M-H]-，判斷其分子量為1088；對其子離子碎片進(jìn)行分析，m/z 955對應(yīng)[M-H-Ara]-、m/z 925對應(yīng)[M-H-Glc]-、m/z 731對應(yīng)[M-H-Glc-Ara-62]-，且碎片離子中含有m/z 455齊墩果酸苷元特征碎片。化合物5與化合物4相比較分子量相同，由于糖基團(tuán)的連接位置不同導(dǎo)致子離子碎片及豐度有所差異，根據(jù)保留時間不同，判斷化合物4和化合物5為同分異構(gòu)體。根據(jù)文獻(xiàn)報道，推斷該化合物為Armatoside[9](圖1D)。

3.1.5化合物6的鑒定化合物6的保留時間為15.2min，負(fù)離子模式下的母離子m/z 1117，判斷其分子量為1118；對其子離子碎片進(jìn)行分析，m/z 793對應(yīng)[M-H-2Glc]-、m/z 731對應(yīng)[M-H-2Glc-62]-、m/z 613對應(yīng)[M-H-3Glc-H2O]-、m/z 570對應(yīng)[M-H-3Glc-H2O-CO2]-、m/z 453對應(yīng)[M-H-3Glc-GlcA-H2]-，推斷此化合物為Elatoside K[10](圖1E)。

A.對照品溶液的總離子流圖，B.人參皂苷Ro的MS/MS圖譜；C.化合物4的MS/MS圖譜；D.化合物5的MS/MS圖譜；E.化合物6的MS/MS圖譜

3.1.6人參和西洋參不同部位齊墩果酸型皂苷的鑒定通過采用LC-MS/MS分析人參和西洋參不同部位的齊墩果酸型皂苷，共鑒定出人參皂苷Ro(1)、竹節(jié)參皂苷Iva(2)、姜狀三七皂苷R1(3)、Stipulenaoside R2(4)、Arrnatoslde(5)和Elatoside K(6)6種齊墩果酸型皂苷，其結(jié)構(gòu)如圖2和表1。其中，人參中共發(fā)現(xiàn)3種齊墩果酸型皂苷，分別為化合物1、化合物2和化合物3，且根、莖、葉中均含有該3種化合物(圖3)；西洋參共檢測出6種齊墩果酸型皂苷，但不同部位中所含化合物種類卻各不相同。根部為該類型皂苷種類分布最多的部位，共6種，而莖、葉相比于根則皂苷種類較少，其中，莖中發(fā)現(xiàn)化合物1、化合物3和化合物4，葉中則僅發(fā)現(xiàn)化合物1和化合物4(圖4)。人參和西洋參不同部位中齊墩果酸型皂苷分布狀況見表2。

圖2 齊墩果酸皂苷元結(jié)構(gòu)

表1齊墩果酸型皂苷結(jié)構(gòu)

Table1Thestructureofoleanolicacidtypesaponins

化合物 CompoundR1R2人參皂苷RoGingsenosideRo-GlcA2-Glc-Glc竹節(jié)參皂苷IvaChikusetsusaponinIva-GlcA-Glc姜狀三七皂苷R1ZingibrosideR1-GlcA2-Glc-HStipulenaosideR2-GlcA3-Glc-Glc | Ara4(f)Armatoside-GlcA2-Glc2-Ara-GlcElatosideK-GlcA2-Glc-Glc | Glc3

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1線性關(guān)系考察從對照品原液中分別取不同體積溶液置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，配制成7個不同濃度的對照品溶液，進(jìn)樣體積10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品溶液的質(zhì)量濃度X(μg/mL)對峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Ro線性方程Y=2.1437x-0.7291，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，0.52μg/mL～62.58μg/mL具有良好的線性范圍。

A.人參根總離子流圖；B.人參根中化合物2和化合物3的提取離子流圖；C.人參莖中化合物2和化合物3的提取離子流圖；D.人參葉中化合物2和化合物3的提取離子流圖A.TIC of ginseng root;B.Extracted ion chromatogram(EIC) of compound 2 and 3 in ginseng root;C.EIC of compound 2 and 3 in ginseng stem;D.EIC of compound 2 and 3 in ginseng leaf

A.西洋參根總離子流圖；B.西洋參根中化合物6的提取離子流圖；C.西洋參根中化合物4和化合物5的提取離子流圖；D.西洋參莖總離子流圖；E.西洋參葉總離子流圖

表2人參和西洋參不同部位中齊墩果酸型皂苷分布狀況

Table2ThedistributioncharacteristicsofoleanolicacidtypesaponinsindifferentpartsofginsengandAmericanginseng

化合物Compound人參根Ginsengroot人參莖Ginsengstem人參葉Ginsengleaf西洋參根Americanginsengroot西洋參莖Americanginsengstem西洋參葉Americanginsengleaf人參皂苷RoGinsenosideRo○○○○○○竹節(jié)參皂苷IvaChikusetsusaponinIva○○○○××姜狀三七皂苷R1ZingibrosideR1○○○○○×StipulenaosideR2×××○○○Armatoside×××○××ElatosideK×××○××

注：○.發(fā)現(xiàn)；×.未發(fā)現(xiàn)。

Note：○.Found；×.No found.

3.2.2精密度實(shí)驗(yàn)取同一濃度對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣體積10μL。測定對照品的色譜峰面積并進(jìn)行積分，經(jīng)計算RSD為0.51%，表明儀器精密度良好。

3.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批供試品，精密稱取0.5g，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件檢測，進(jìn)樣體積10μL。測定人參皂苷Ro的色譜峰面積并進(jìn)行積分，經(jīng)計算RSD為1.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于制備后0h、4h、8h、12h、24h檢測，進(jìn)樣體積10μL。測定人參皂苷Ro的色譜峰面積并進(jìn)行積分，經(jīng)計算RSD為0.38%，表明該供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批已知含量西洋參供試品6份，每份0.5g，分別加入人參皂苷Ro對照品原液(1.043mg/mL)1mL，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜方法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Results of recovery test

3.3 人參皂苷Ro含量分析

3.3.1人參各部位人參皂苷Ro含量分析人參中人參皂苷Ro主要積累于根部，平均含量為0.214%，約占根、莖和葉中人參皂苷Ro總含量的75.09%。而莖和葉中該化合物的相對含量較低，平均含量分別為0.051%和0.020%，二者僅占總含量的24.91%。比較莖、葉中人參皂苷Ro的含量發(fā)現(xiàn)，莖中人參皂苷Ro含量占莖和葉總含量的71.83%，而葉中人參皂苷Ro含量僅為28.17%，莖中含量約為葉中含量的2.55倍。通過對根、莖和葉的人參皂苷Ro含量比較分析得出，人參各部位中人參皂苷Ro的含量比較順序?yàn)楦?莖>葉，相對應(yīng)部位含量比例約為10.7∶2.6∶1(表4)。

表4人參不同部位中人參皂苷Ro含量

Table 4 Relative percentage of ginsenoside Ro in different parts of ginseng (%)

3.3.2西洋參各部位人參皂苷Ro含量分析西洋參中人參皂苷Ro也主要積累于根部，平均含量為0.576%，約為根、莖和葉中總含量的94.89%。莖和葉中該化合物相對含量極低，平均含量為0.022%和0.009%，且兩者僅占總含量的5.11%。相比較莖、葉中含量的發(fā)現(xiàn)，莖中人參皂苷Ro含量占莖和葉總量的70.97%，而葉中則為29.03%。通過對西洋參根、莖和葉中人參皂苷Ro的含量比較分析后得出，各部位含量大小順序?yàn)楦?莖>葉，相對應(yīng)部位含量比例約為64.0∶2.5∶1(表5)。

表5西洋參不同部位中人參皂苷Ro含量

Table 5 Relative percentage of ginsenoside Ro in different parts of American ginseng (%)

3.3.3人參和西洋參各部位人參皂苷Ro含量比較通過對人參、西洋參各部位含量的測定發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Ro均主要分布于兩者的根部，但西洋參明顯高于人參，約為人參的2.69倍。二者莖和葉中的含量均較低，尤其是西洋參，但是比較莖、葉中的含量發(fā)現(xiàn)，人參莖葉含量卻高于西洋參，約為西洋參的2.29倍。雖然在含量差異方面理論倍數(shù)與上述根部較為接近，但卻與其它情況相反。通過對比人參和西洋參各部位中人參皂苷Ro含量比例得出，各自莖和葉中的含量比例基本接近，但二者總和占各自植株總量比例不同，以根部含量為最高。由此得出，二者根部均為人參皂苷Ro積累的主要部位，尤其以西洋參更為顯著。

4 討論

目前，對于人參和西洋參主要活性成分的研究主要以達(dá)瑪烷型皂苷為主[11～13]，而齊墩果酸型皂苷的研究則相對較少[14]。本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)6種齊墩果酸型皂苷，其中3種在西洋參中首次發(fā)現(xiàn)，西洋參中齊墩果酸型皂苷的種類較人參中豐富。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Ro為人參和西洋參中含量最高的齊墩果酸型皂苷[15]，因此在含量分析方面具有研究代表性。

本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Ro在人參和西洋參中的含量順序均為根>莖>葉，根部為其主要積累部位，而莖、葉中含量甚低。這與人參和西洋參葉中達(dá)瑪烷型皂苷含量豐富可作為人參皂苷的來源有較大差異[13，16]。形成這一現(xiàn)象的原因可能由于人參皂苷Ro為齊墩果酸型五環(huán)三萜類皂苷，與達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷在結(jié)構(gòu)上有本質(zhì)區(qū)別，在生物合成過程中，后者在含量和多樣性上高于前者而導(dǎo)致兩種類型皂苷成分在不同部位中含量分布有所差異[17]。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了齊墩果酸型皂苷在人參和西洋參不同部位中種類及人參皂苷Ro含量的分布特征，結(jié)果表明，齊墩果酸型皂苷次生代謝產(chǎn)物的主要積累部位為根部，與達(dá)瑪烷型皂苷次生代謝產(chǎn)物在莖、葉中的積累規(guī)律形成鮮明對比，從而完善了人參和西洋參中三萜類皂苷成分的分布特征。

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