逄世峰，閆梅霞，崔麗麗，李亞麗，郭靖※，楊珺

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112； 2．長春市公安局司法鑒定中心，長春 130122)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.)Link]是蟲草屬的模式種，在生物分類學(xué)上與冬蟲夏草(Cordycepssinensis)同為蟲草屬[1]，由于天然冬蟲夏草的資源非常有限，作為冬蟲夏草代替品的蛹蟲草已被越來越多的人接受[2]。

蟲草素和腺苷是蟲草的主要活性成分，蟲草素具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種生物活性[3]，腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種活性[4]。超高效液相色譜(UPLC)儀為目前被證實最高效的分離儀器，具有分離時間短、靈敏度高等特點[5]，目前，尚未見在腺苷和蟲草素分析方面的應(yīng)用。本試驗建立一種蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量測定方法，旨在為蛹蟲草質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要材料、儀器和試劑

蛹蟲草子實體(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所新藥創(chuàng)制研究室培養(yǎng))；超高效液相色譜儀ACQUITY(Waters公司)；腺苷標準品(四川維克奇生物科技有限公司)；蟲草素(廣州寬林科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動相：甲醇-水(15∶85)；流速：0.3mL/min；檢測波長：260nm；柱溫：35℃；進樣量：2μL。

1.3 對照品溶液制備

精密稱取腺苷對照品5.61mg、蟲草素對照品1.72mg，分別置100mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

1.4 樣品溶液制備[6]

蛹蟲草子實體自然晾干至恒重，取出，粉碎，過60目篩，將過篩后的粉末放入自封袋中并置于干燥器中保存。準確稱取樣品粉末0.1g于50mL離心管中，精密移取25mL超純水，密封，超聲(功率500W、頻率40kHz)提取2h，10 000r/min離心10min，取上清，過0.2μm微孔濾膜，供UPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

腺苷和蟲草素常用的提取方法有加熱回流提取法和超聲提取法，為防止腺苷高溫不穩(wěn)定[6]，本研究采用了超聲提取方法。

腺苷和蟲草素常用的提取溶劑有水和甲醇[4，7]，本研究考察了這2種溶劑對蛹蟲草中腺苷和蟲草素的提取效果，結(jié)果表明，水提取腺苷效果優(yōu)于甲醇，而甲醇提取蟲草素效果略優(yōu)于水(表1)。

表1不同提取溶劑對蛹蟲草中腺苷、蟲草素含量的影響

Table1EffectsofsolventsonextractionofadenosineandcordycepinfromculturedC.militaris(mg/g)

提取溶劑Extractionsolvent腺 苷Adenosine蟲草素Cordycepin水 Water1.1550.336甲醇 Methanol0.2440.345

2.2 樣品溶解溶液的選擇

本研究考察了標準品水溶液和甲醇溶液對色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當標準品用甲醇溶解時，峰較寬，且圓角；水溶解時，峰形尖銳，色譜分離效果較好。

2.3 色譜柱的選擇

本研究比較了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)。結(jié)果表明，ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱對腺苷和蟲草素保留較強，更利于腺苷和蟲草素的分離。

2.4 流動相的選擇

《中國藥典》中采用磷酸鹽緩沖溶液和甲醇作為色譜分離流動相[7]，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水洗脫系統(tǒng)對色譜分離的影響發(fā)現(xiàn)，不用緩沖鹽依然能得到較好的分離效果，乙腈-水洗脫系統(tǒng)中腺苷稍微拖尾，15%甲醇-水作為流動相時，色譜峰對稱，峰形較好。

2.5 線性關(guān)系與檢出限、定量限

取對照品溶液，分別進樣不同體積，以進樣質(zhì)量(ng)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)由3倍和10倍信噪比計算而來，結(jié)果見表2。

表2線性回歸方程與LOD、LOQ

Table 2 Linear regression data,LOD and LOQ

2.6 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“1.2”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、蟲草素峰面積的RSD分別為0.49%和0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0h、4h、8h、12h、16h進樣，測定腺苷、蟲草素的峰面積。結(jié)果腺苷、蟲草素峰面積的RSD分別為1.7%和2.3%，表明溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率

精密稱定已知含量的蛹蟲草粉末6份，置離心管中，添加對照品溶液1mL，精密移取24mL超純水，按“1.4”項下方法制備樣品溶液，在上述色譜條件下測定，結(jié)果見表3。

表3加樣回收率

Table 3 Recovery of sample (n=6)

2.9 樣品測定

按照“1.4”項下方法制備樣品溶液，按照“1.2”項下色譜條件測定樣品，得蛹蟲草子實體中腺苷和蟲草素含量為1.22mg/g和0.28mg/g，色譜圖見圖1。

1.腺苷；2.蟲草素 1.Adenosine;2.Cordycepin

3 結(jié)論

超高效液相色譜是一個新興的領(lǐng)域，目前尚未見在腺苷和蟲草素分析中應(yīng)用，本試驗建立了蛹蟲草子實體中腺苷和蟲草素含量的UPLC檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比較，流動相中無需添加緩沖鹽，且在1.7min完成測定，該方法簡便、快捷，可用于蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量測定及質(zhì)量控制。

[1]張姝,張永杰,SHRESTHA Bhushan,等.冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌的研究現(xiàn)狀、問題及展望[J].菌物學(xué)報,2013,32(4):577.

[2]桂仲爭,朱雅紅.蛹蟲草的人工培育、有效成分及藥理作用研究進展[J].蠶業(yè)科學(xué),2008,34(1):178.

[3]楊濤,董彩虹.蟲草素的研究開發(fā)現(xiàn)狀與思考[J].菌物學(xué)報,2011,30(2):180.

[4]毛新亮,鄭國棟,張晨,等.反相高效液相色譜法同時測定冬蟲夏草中腺苷、蟲草素、肌苷含量方法的研究[J].中南藥學(xué),2009,7(12):895.

[5]金高娃,章飛芳,薛興亞.超高效液相色譜在復(fù)雜體系中藥分離分析中的應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù),2006,8(3):106-110.

[6]郭澄,朱杰,張純,等.高效液相色譜法測定人工蟲草菌絲中腺苷和蟲草素的含量[J].中國中藥雜志,1998,23(4):236.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[K].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:106.