李新華,齊曉軍,閆 榮,錢丹丹,于金躍

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

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玉米麩質(zhì)粉中殘留淀粉分離技術(shù)方法與機(jī)理研究

李新華,齊曉軍,閆 榮,錢丹丹,于金躍

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

對玉米麩質(zhì)用尿素、吐溫80、NaCl、L-半胱氨酸水溶液浸泡4、8、12h,碘顯色法測定處理后麩質(zhì)中游離淀粉的含量,并采用光學(xué)顯微鏡對處理后的麩質(zhì)中分子間的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察,直觀地看出尿素、吐溫80、NaCl、L-半胱氨酸均可使與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的淀粉顆粒游離出來,且主要是體積較小的角質(zhì)區(qū)淀粉顆粒。實(shí)驗(yàn)說明玉米麩質(zhì)中的淀粉主要以二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合,但還有通過靜電引力、疏水作用和氫鍵結(jié)合的淀粉。

玉米麩質(zhì),二硫鍵,靜電引力,氫鍵,疏水作用

玉米麩質(zhì)粉(Corn Gluten Meal,CGM)是濕法生產(chǎn)淀粉時分離出的副產(chǎn)物。玉米麩質(zhì)粉主要用做飼料[1-3],也可用于提取醇溶蛋白[4-5]、谷蛋白[6]與黃色素[7-8]。麩質(zhì)中除蛋白質(zhì)外,還有一定比例的結(jié)合淀粉,這部分難以提取出來的淀粉,與蛋白質(zhì)存在著特定的結(jié)構(gòu)形式,目前玉米的濕法生產(chǎn)工藝很難使之分離,國外一些研究發(fā)現(xiàn),淀粉與蛋白質(zhì)之間的復(fù)合不是由單一作用完成的,而是共價鍵、靜電力、范德華力、氫鍵、疏水作用、離子鍵、容積排阻作用及分子纏繞等綜合作用的結(jié)果,玉米濕磨工藝在很大程度上打破了這種結(jié)合,而留存在麩質(zhì)粉中的淀粉其結(jié)合強(qiáng)度顯然更大,如何打破這種結(jié)合,實(shí)現(xiàn)玉米淀粉與蛋白質(zhì)的完全分離,國內(nèi)外研究報(bào)道較少?；瘜W(xué)試劑與淀粉或蛋白質(zhì)分子間的作用有利于破壞淀粉-蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)之間的作用力[9]。本文以麩質(zhì)粉為試材,采用化學(xué)試劑法測定麩質(zhì)中淀粉與蛋白質(zhì)作用力,借助光學(xué)顯微鏡觀察化學(xué)試劑處理前后玉米麩質(zhì)中淀粉和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,為提取玉米麩質(zhì)粉中的淀粉以及獲得純度更高的玉米蛋白粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米麩質(zhì)粉 購于魯州生物科技(遼寧)有限公司,經(jīng)過篩處理成60目的粒狀麩質(zhì);可溶性淀粉 市售;尿素、吐溫80、NaCl、L-半胱氨酸(L-Cys)、Ca(NO3)2、I2、KI 均為市售,分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;EL-204電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金云市杰瑞爾電器有限公司;金相顯微鏡BX41 日本OLYMPUS;高速冷凍離心機(jī)himac CR-21G 北京安捷來勒科技有限公司;真空干燥箱 北京恒泰豐科實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麩質(zhì)的處理 稱取1g麩質(zhì),分別用200mL的水(空白)、尿素(1%、2%、4%)、吐溫80(3%、5%、8%)、NaCl(3%、5%、8%)、L-半胱氨酸(1%、2%、3%)水溶液在28℃(該溫度維持蛋白質(zhì)與淀粉良好的結(jié)構(gòu)與性質(zhì))水浴鍋中浸泡4、8、12h,將同一時間段處理完的麩質(zhì)離心(8000r/min,4min,4℃),棄上清液,殘?jiān)谜麴s水懸浮洗滌、離心兩次,殘?jiān)鼈溆谩?/p>

1.2.2 玉米麩質(zhì)粉的主要成分檢測

1.2.2.1 玉米麩質(zhì)粉淀粉含量測定 分光光度法。

1.2.2.2 玉米麩質(zhì)粉蛋白質(zhì)含量測定 參照 GB 5009.5-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定。

1.2.2.3 玉米麩質(zhì)粉水分含量測定 參照 GB 5009.3-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定。

1.2.2.4 玉米麩質(zhì)粉脂類含量測定 參照 GB 5009.3-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定。

1.2.4 光學(xué)顯微鏡觀察 麩質(zhì)處理如1.2.1,將離心后的殘?jiān)尤氲攘康乃?攪勻,用移液槍取1mL放在載玻片上,用碘-碘化鉀法染色,染色后淀粉顆粒成藍(lán)色,蛋白質(zhì)成黃色。于4×100倍顯微鏡下觀察化學(xué)試劑處理前后麩質(zhì)顆粒的宏觀變化并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS Statistics17.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。簡單的分析和作圖用Excel、Word軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離淀粉含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出,碘顯色法測淀粉的吸光度得其線性回歸方程:Y=0.0113X-0.003,r=0.9997。

圖1 淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of starch

2.2 玉米麩質(zhì)粉中主要成分及含量

玉米麩質(zhì)粉中主要成分及含量如表1，玉米麩質(zhì)粉中主要成分為蛋白質(zhì)、其次是淀粉。

表1 玉米麩質(zhì)粉中主要成分及含量(%)Table 1 The main composition and content in CGM(%)

2.3 化學(xué)試劑對玉米麩質(zhì)粉中蛋白質(zhì)與淀粉結(jié)構(gòu)的影響

采用不同化學(xué)試劑處理玉米麩質(zhì)粉,測定處理后試樣中游離淀粉的含量,游離淀粉含量越多,說明該試劑對其結(jié)構(gòu)作用強(qiáng)度越大。

2.3.1 尿素處理對麩質(zhì)粉中蛋白質(zhì)與淀粉結(jié)構(gòu)的影響 由圖2可示,麩質(zhì)經(jīng)1%、2%、4%濃度的尿素處理,浸泡4、8、12h時麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量大于水處理,且隨著浸泡時間、浸泡試劑濃度的增加,游離出來的淀粉的量也增加,且4%尿素處理效果最好,游離出來的淀粉含量變化差異顯著(p<0.05)。

圖2 不同濃度尿素處理后麩質(zhì)中游離淀粉含量Fig.2 The content of free starch in gluten treated with urea in different concentrations

2.3.2 吐溫80處理對麩質(zhì)粉中蛋白質(zhì)與淀粉結(jié)構(gòu)的影響 由圖3可示,麩質(zhì)經(jīng)3%、5%、8%濃度的吐溫80處理,以水為空白對照,4、8、12h時麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量大于水處理,且隨著浸泡時間的增加,經(jīng)水、吐溫80處理游離出來的淀粉的量也增加,且5%吐溫80處理效果最好,麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量變化差異顯著(p<0.05)。

圖3 不同濃度吐溫處理前后麩質(zhì)中游離淀粉含量Fig.3 The content of free starch in gluten treated with Tween 80 in different concentrations

2.3.3 氯化鈉處理后游離淀粉的含量 由圖4可知,麩質(zhì)經(jīng)3%、5%、8%濃度的NaCl處理,4、8、12h時麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量大于水處理,且隨著浸泡時間的增加,經(jīng)水、NaCl處理游離出來的淀粉的量也增加,且8% NaCl處理效果最好。麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量變化差異顯著(p<0.05)。

圖4 不同濃度NaCl處理前后麩質(zhì)中游離淀粉含量Fig.4 The content of free starch in gluten treated with NaCl in different concentrations

2.3.4L-半胱氨酸處理后游離淀粉的含量 由圖5可示,麩質(zhì)經(jīng)1%、2%、3%濃度的L-半胱氨酸處理,以水為空白對照,4、8、12h時麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量大于水處理,且隨著浸泡時間的增加,經(jīng)水、L-半胱氨酸處理游離出來的淀粉的量也增加,且3%L-半胱氨酸處理效果最好。麩質(zhì)中游離出來的淀粉含量變化差異顯著(p<0.05)。

圖5 不同濃度L-半胱氨酸處理前后麩質(zhì)中游離淀粉含量Fig.5 The content of free starch in gluten treated with L-cysteine in different concentrations

2.4 不同化學(xué)試劑處理結(jié)果比較

對麩質(zhì)粉浸泡12h,處理效果最好的4%尿素、5%吐溫80、8% NaCl、3%L-半胱氨酸與水做對比再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6可示。

圖6 不同試劑處理麩質(zhì)12h后游離出來的淀粉含量Fig.6 The content of free starch in gluten treated with different reagents for 12h

圖6表明,四種化學(xué)試劑處理麩質(zhì)游離出來的淀粉含量為3%L-半胱氨酸>8% NaCl>5%吐溫>4%尿素。分析認(rèn)為,L-半胱氨酸破壞麩質(zhì)中二硫鍵能力較強(qiáng),NaCl破壞麩質(zhì)中靜電引力較強(qiáng),尿素破壞麩質(zhì)中氫鍵和疏水作用較弱,吐溫破壞麩質(zhì)中疏水作用較弱。

2.5 光學(xué)顯微鏡觀察

在100倍物鏡下,可以清晰的觀察到經(jīng)4%尿素、5%吐溫、8% NaCl、3%L-半胱氨酸水溶液浸泡12h的顯微圖片如圖7所示。

圖7 100倍物鏡下不同化學(xué)試劑處理前后麩質(zhì)的顯微圖片F(xiàn)ig.7 Photomicrograph under 100 times lens of gluten before and after treated with different reagents

圖7觀察到黑色的是淀粉顆粒,灰色的是蛋白質(zhì)顆粒?？梢钥闯鲇迷噭┨幚砬?麩質(zhì)中的蛋白質(zhì)顆粒與淀粉顆粒連接非常緊密,相互嵌合,且蛋白質(zhì)顆粒大小差異不大,結(jié)構(gòu)緊密,蛋白質(zhì)相互粘連,重疊,蛋白質(zhì)顆粒間空隙小,晶體外形排列整齊,淀粉與蛋白質(zhì)相互粘連,重疊,淀粉顆粒比較大(圖7a)。經(jīng)4%的尿素處理,麩質(zhì)中的蛋白質(zhì)顆粒與淀粉顆粒連接不緊密,排列明顯疏松,視野中的蛋白質(zhì)顆粒排列明顯疏松,碎片較多,以大碎片為主,呈無序狀態(tài),麩質(zhì)顆粒之間空隙增大,晶體外形排列不整齊,淀粉顆粒游離出來,且顆粒比較小(圖7b)。經(jīng)5%吐溫處理,麩質(zhì)中的蛋白質(zhì)顆粒與淀粉顆粒連接不緊密,有淀粉顆粒與蛋白質(zhì)粘連,有淀粉顆粒完全游離出來,有的還被蛋白質(zhì)顆粒完全包裹,視野中的蛋白質(zhì)碎片較多,以大碎片為主,游離出來的淀粉顆粒成橢圓形,且顆粒較小(圖7c)。經(jīng)8%氯化鈉處理,麩質(zhì)中的淀粉顆粒與蛋白質(zhì)顆粒連接非常不緊密,視野中蛋白質(zhì)與淀粉顆粒碎片較多,蛋白質(zhì)碎片以小碎片為主,視野中的淀粉顆粒較小,有的不是橢圓形(圖7d)。經(jīng)3%L-半胱氨酸處理,淀粉顆粒與蛋白質(zhì)顆粒連接不緊密,淀粉顆粒從蛋白質(zhì)顆粒之間游離出來,麩質(zhì)顆粒間空隙增大,排列疏松,呈無序狀態(tài),晶體外形排列不整齊,游離出來的淀粉顆粒呈橢圓形,顆粒比較小(圖7e)。顯微觀察只能看出未處理麩質(zhì)與化學(xué)試劑處理后麩質(zhì)顆粒的宏觀變化,更為細(xì)致的顆粒變化會進(jìn)一步研究觀察。

3 討論

3.1 麩質(zhì)粉中存在淀粉與蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)合

有文獻(xiàn)記載,尿素能夠通過與溶質(zhì)直接相互作用、改變?nèi)苜|(zhì)水化層、改變水分子體積結(jié)構(gòu)或其綜合作用增加極性和非極性溶質(zhì)在水溶液中的溶解性[12],用尿素浸泡麩質(zhì)時,由于尿素分子中的氫原子與蛋白質(zhì)肽鏈中的氧原子相作用而形成氫鍵,這樣使肽鏈自身可形成的氫鍵減少,使多肽分子中靠氫鍵維系的二級結(jié)構(gòu)如螺旋、折疊、自由回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)遭到破壞,使麩質(zhì)中的蛋白分子伸展變性溶解,從而使與蛋白質(zhì)相結(jié)合的淀粉游離出來,尿素的濃度越大,尿素溶液中氫原子越多,與麩質(zhì)中氧原子結(jié)合形成氫鍵越多,對靠氫鍵維系的二級結(jié)構(gòu)破壞越大,從而使與蛋白質(zhì)復(fù)合的淀粉游離出來也越多。有文獻(xiàn)記載,具有鹽溶效應(yīng)的尿素還能使溶劑體系的溶劑促簇能力降低,使臨界膠束濃度增大,破壞疏水相互作用,從而使簇集者的簇集傾向性減少[12]。實(shí)踐與理論分析表明,尿素通過破壞蛋白質(zhì)之間的氫鍵結(jié)構(gòu)和疏水相互作用強(qiáng)烈地影響蛋白質(zhì)分子-淀粉分子低溫下的相互作用,使體系的彈性、弛豫時間和單一的松弛過程降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在麩質(zhì)粉中的難分離淀粉與蛋白質(zhì)的結(jié)合仍符合上述規(guī)律,但靠打破氫鍵釋放出來的游離淀粉量相對較少,說明在麩質(zhì)粉中氫鍵結(jié)合的淀粉比例較小。

3.2 麩質(zhì)粉中的靜電力與疏水作用

吐溫80為非離子型表面活性劑,表面活性劑由兩部分構(gòu)成:一部分是非極性的疏水基,另一部分是極性的親水基,疏水相互作用是通過疏水物的疏水基于水相互排斥作用而發(fā)生的,它對大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常關(guān)鍵,蛋白質(zhì)同時含極性和非極性的基團(tuán),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于吐溫80水溶液中時,極性基團(tuán)之間以及極性基團(tuán)與吐溫80水溶液之間易發(fā)生靜電吸引而排開非極性水基團(tuán)。實(shí)踐與理論分析表明吐溫80正是通過疏水基插入蛋白質(zhì)疏水空腔,打亂疏水區(qū)的平衡,破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而使淀粉與蛋白質(zhì)之間的相互作用降低,淀粉游離出來。

靜電引力是由萬有引力引起,金屬離子Na+能使蛋白質(zhì)極性表面脫水,增加蛋白質(zhì)分子間引力,同時減少蛋白質(zhì)分子間負(fù)電荷排斥作用,改變大分子構(gòu)象穩(wěn)定,促進(jìn)蛋白質(zhì)分子發(fā)生疏水聚集[13-14],蛋白質(zhì)表面疏水作用力下降,從而同時降低了與淀粉分子之間的靜電引力。實(shí)踐與理論分析表明NaCl正是破壞了蛋白質(zhì)表面的疏水作用力,從而使蛋白質(zhì)與淀粉之間的靜電引力下降,淀粉游離出來。

本實(shí)驗(yàn)中依靠打破疏水作用和靜電力作用釋放出來的游離淀粉含量相近,但都大于打破氫鍵力釋放出來的游離淀粉量,說明靜電力和疏水作用還是麩質(zhì)粉中淀粉與蛋白質(zhì)結(jié)合的主要因素。

3.3 麩質(zhì)粉中的二硫鍵結(jié)合力

二硫鍵為一個半胱氨酸的-SH與同鏈或鄰鏈另一半胱氨酸的-SH氧化連接而成,是蛋白質(zhì)分子中的重要化學(xué)鍵,L-半胱氨酸分子中含有具有還原性的巰基(-SH),且L-半胱氨酸破壞二硫鍵能力較強(qiáng)[15-16];加入2%L-半胱氨酸,L-半胱氨酸中-SH可以與蛋白質(zhì)中的二硫鍵的一個半胱氨酸的-SH競爭,從而破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵,破壞了蛋白質(zhì)的二硫鍵,可使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松懈,從有規(guī)則的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)殚_鏈的不規(guī)則和散漫的排列形式。實(shí)踐與理論分析表明,L-半胱氨酸正是通過破壞麩質(zhì)中蛋白質(zhì)的二硫鍵,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不規(guī)則,從而破壞了蛋白質(zhì)與淀粉之間的作用力,使淀粉游離出來。本實(shí)驗(yàn)依靠打破蛋白質(zhì)與淀粉之間的二硫鍵釋放出來的游離淀粉量最大,說明在麩質(zhì)粉中難分離的淀粉仍以二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合,要最大限度地分離麩質(zhì)粉中的淀粉,應(yīng)采取克服二硫鍵結(jié)合的技術(shù)方法。

4 結(jié)論

不同化學(xué)試劑處理麩質(zhì)游離出來的淀粉含量為:3%L-半胱氨酸>8% NaCl>5%吐溫>4%尿素,經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察,直觀的看出尿素、吐溫、NaCl、L-半胱氨酸均可使與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的淀粉顆粒游離出來,且主要是體積較小的角質(zhì)區(qū)淀粉顆粒。實(shí)驗(yàn)說明玉米麩質(zhì)中的淀粉主要以二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合,但還有通過靜電力、疏水作用和氫鍵結(jié)合的淀粉,要最大程度地分離麩質(zhì)粉中的淀粉,首先應(yīng)采用打破二硫鍵的技術(shù)方法,并要兼顧采用其他分離工藝。

[1]華雪銘,王軍,韓斌,等.玉米蛋白粉在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2011(4):627-635.

[2]俞路,王雅倩,章世元,等.玉米蛋白飼料在櫻桃谷肉鴨日糧中的應(yīng)用研究[J].中國飼料,2008(10):12-15.

[3]張槐椿,蔡克周,陳小兵,等.豐原玉米蛋白飼料在生長育肥豬中的應(yīng)用研究[J].江西飼料,2007(3):12-14.

[4]Kwiatkowski J R,McAloon A J,Taylor F,et al. Modeling the process and costs of fuel ethanol production by the corn dry-grind process[J].Crops Prod,2006,23:288-296.

[5]王大為,邵信儒,張艷榮.超臨CO2萃取對玉米醇溶蛋白提取率及水解度影響的研究[J].食品科學(xué),2005,26(8):166-169.

[6]李運(yùn)罡,李夢琴,張劍,等.曲面法提取玉米谷蛋白工藝優(yōu)化研究[J].糧食與飼料工業(yè),2008(9):24-28.

[7]曹龍奎,包鴻慧,周睿.玉米黃色素超臨界CO2流體萃取技術(shù)及穩(wěn)定性研究[J].糧食與飼料工業(yè),2008(3):10-12,16.

[8]趙華,王虹,任晶,等.響應(yīng)面法對玉米黃色素提取工藝的優(yōu)化[J].糧食與飼料工業(yè),2010(12):42-44.

[9]de Kruif C G,Tuinier R. Polysaccharide protein interactions[J].Food hydrocolloids,2001,15:555-563.

[10]徐昌杰,陳文峻,陳昆松,等.淀粉含量測定的一種簡便方法———碘顯色法[J].生物技術(shù),1998,8(2):41-43.

[11]荊家海,丁鐘榮,韓錦峰.植物生物化學(xué)分析方法[M].北京,科學(xué)出版社,1981:161-164.

[12]劉廷國,楊凌霄,周彬,等.殼聚糖與尿素的相互作用及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].離子交換與吸附,2012,28(2):183-192.

[13]Wszelaka M,Zielenkiewicz W. Enthalpy change of salting processes of hen egg white lysozyme in various electrolyte solu-tions[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry,2006,83(3):607-610.

[14]Stadelman W J,Cotterill O J. Egg Science and Technology[M].New York:Haworth Press,1995:405-463.

[15]汪多仁.L-半胱氨酸的開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊,2012,41(1):35-41.

[16]徐國恒.二硫鍵與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[J].生物學(xué)通報(bào),2010,45(5):5-6.

Study on separation technology method and mechanism ofresidual starch in corn gluten powder

LI Xin-hua,QI Xiao-jun,YAN Rong,QIAN Dan-dan,YU Jin-yue

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Corn glute was soaked with urea,Tween 80,NaCl,L-cysteine solution for 4,8 and 12h,the content of free starch in treated gluten was measured by the method of iodine colorimetric,and the structure among the molecules in treated gluten was analyzed by optical microscope. Through optical microscope,it was intuitive to see starch kernels that bind to proteins,especially small volume cutin starch granule,free from protein,which was made by urea,Tween 80,NaCl,andL-cysteine. The study showed that the key force between starch in corn gluten and proteins was disulfide bonds,but electrostatic attraction,hydrophobic effect and hydrogen bond also exited.

corn gluten;disulfide bonds;electrostatic attraction;hydrogen bond;hydrophobic effect

2014-05-19

李新華(1955-),男,博士,教授,研究方向:糧油加工與轉(zhuǎn)化。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171782)。

TS231

A

1002-0306(2015)05-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.003