別同德， 高德榮，2， 張 曉， 莊麗芳， 趙仁慧， 陳甜甜， 張伯橋

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225007;2.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434023;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

簇毛麥(Haynaldia villosa，2n=14，VV)是小麥野生近緣種，具有多花、多實(shí)、抗多種病害等有利性狀，是小麥遺傳改良重要基因資源［1］。陳佩度等利用英國(guó)劍橋植物園引進(jìn)的簇毛麥育成了抗白粉病小麥-簇毛麥T6VS.6AL易位系［2］。由于6V染色體短臂上載有抗白粉病基因Pm21，對(duì)現(xiàn)有已知白粉病小種均表現(xiàn)免疫，受到國(guó)內(nèi)外小麥育種界關(guān)注。上世紀(jì)90年代以來(lái)，T6VS.6AL易位系在小麥抗白粉病育種中得到廣泛利用，迄今已育成南農(nóng)9918、內(nèi)麥9號(hào)、石麥14、揚(yáng)麥18等20余個(gè)高抗白粉病小麥品種［3］。

為研究T6VS.6AL易位的遺傳效應(yīng)，Li等［4］利用5個(gè)組合14個(gè)回交高代品系研究了T6VS.6AL易位的農(nóng)藝和品質(zhì)效應(yīng)。由于單組合內(nèi)樣本少、品系間各性狀變異幅度較大、各品系生態(tài)適應(yīng)型不同等復(fù)雜因素，T6VS.6AL易位的遺傳效應(yīng)多為傾向性結(jié)論。

程順和等［5］認(rèn)為品種育成初期存在剩余變異，存在種性再加工的可能性和必要性。一個(gè)品種的育成一般需要10多代的選擇和純化，單一品種內(nèi)不同個(gè)體間遺傳組成已高度一致，但天然的純系是沒(méi)有的，品種基因組內(nèi)仍然會(huì)存在較低頻率的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性也表現(xiàn)為表型上的細(xì)微差異。由異質(zhì)位點(diǎn)衍生的高代姊妹系間構(gòu)成了天然的近等基因系關(guān)系。與寡樣本近等基因系(NIL)相比，我們認(rèn)為針對(duì)同一異質(zhì)位點(diǎn)構(gòu)建較大樣本量的高代姊妹系組群，可以弱化或中和其他異質(zhì)位點(diǎn)(遺傳背景)的影響，有利于凸顯目標(biāo)異質(zhì)位點(diǎn)的各類(lèi)遺傳效應(yīng)。

揚(yáng)麥18是利用T6VS.6AL易位系育成的抗白粉病弱筋小麥新品種?；诒狙芯啃枰?，自2007年開(kāi)始，對(duì)揚(yáng)麥18參加區(qū)域試驗(yàn)的原始種子(參試名稱(chēng):揚(yáng)03G12)進(jìn)行了株行種植和抗病鑒定，在其中發(fā)現(xiàn)少量白粉病抗性分離株行，對(duì)這些抗白粉病單株、感白粉病單株進(jìn)行多年自交純化，構(gòu)建了抗病系組群和感病系組群，為準(zhǔn)確評(píng)估T6VS.6AL易位的遺傳效應(yīng)提供了寶貴材料。

本研究將通過(guò)上述抗病系組群與感病系組群的比較，系統(tǒng)分析T6VS.6AL易位對(duì)小麥農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的影響，以期為T(mén)6VS.6AL易位的育種利用提供有益的建議。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

揚(yáng)麥18是由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所培育的高抗白粉病品種，由南農(nóng)P045與揚(yáng)麥88-128的雜種F1與揚(yáng)麥158回交5次，再與寧麥9號(hào)回交3次獲得。簇毛麥(2n=14，VV)種質(zhì)來(lái)自英國(guó)劍橋植物園。抗性供體南農(nóng)P045是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所培育的T6VS.6AL抗白粉病易位系。抗白粉病、感白粉病高代姊妹系由參加區(qū)域試驗(yàn)的揚(yáng)麥18原始種子中抗性雜合株自交純化獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗白粉病和感白粉病姊妹系細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記鑒定 根尖細(xì)胞(RTC)制片參照Gill等［6］的方法。簇毛麥基因組DNA提取參照Sharp等［7］的方法?；蚪M原位雜交(GISH)程序參照Z(yǔ)hang等［8］的方法。GISH圖像通過(guò)SPOT CCD獲取。

分子標(biāo)記鑒定采用Bie等［9］開(kāi)發(fā)的6V染色體短臂末端特異性EST-STS標(biāo)記6VS－381，其正向引物序列為5′-CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3′，反向引物序列為5′-TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3′。PCR反應(yīng)體系25 μl，包括50 ng模板DNA，左右引物終濃度各0.2 μmol/L，200 mmol/L dNTP，1 U Taq DNA聚合酶，1×聚合酶專(zhuān)用Buffer(TaKaRa公司生產(chǎn))。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;然后94℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色參照Sourdille等的方法［10］。

1.2.2 田間試驗(yàn)、農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析

大田試驗(yàn)每個(gè)株系種3行，行長(zhǎng)1.5 m，行距25 cm，每行40株。保持試驗(yàn)區(qū)內(nèi)肥水運(yùn)籌一致，抗感株系穿插種植以減少局部肥水不均給統(tǒng)計(jì)值帶來(lái)的偏差。與此同時(shí)，各株系在大棚中鑒定白粉病抗性。成熟前，每株系隨機(jī)抽取30株，考查株高、穗長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)度、每穗小穗數(shù)、小穗密度(用1 cm穗長(zhǎng)中小穗數(shù)表示)、單株總粒數(shù)、每穗粒數(shù)、每株穗數(shù)等主要農(nóng)藝參數(shù)。完熟后，測(cè)定千粒質(zhì)量和株行產(chǎn)量。各類(lèi)農(nóng)藝參數(shù)按白粉病抗性表現(xiàn)分為抗、感2個(gè)組群進(jìn)行方差分析，因2個(gè)組群樣本量均大于30，故采用μ測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行抗、感組群間差異顯著性檢測(cè)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Microsoft Excel軟件。

1.2.3 品質(zhì)測(cè)試和統(tǒng)計(jì)分析 參照AACC 26-20方法，用國(guó)產(chǎn)無(wú)錫布勒實(shí)驗(yàn)?zāi)?MLU-202)制備面粉。潤(rùn)麥(將小麥調(diào)整至目標(biāo)水分含量14.5%，磨粉前再上調(diào)0.5%)時(shí)間為12～18 h，所需潤(rùn)麥加水量(ml)=［(100-原始水分)/(100-所需水分)-1］×樣品質(zhì)量(g)。

面粉溶劑保持力(SRC)按AACC 56-11方法分別測(cè)定水SRC、50%乳酸SRC、5%碳酸鈉SRC和50%蔗糖SRC，重復(fù)2次。

籽粒蛋白質(zhì)含量采用瑞典Perten公司生產(chǎn)的DA7200整粒型近紅外分析儀測(cè)定，樣品用量15 g左右，重復(fù)2次。

籽粒硬度采用瑞典Perten公司生產(chǎn)的SKCS-4100型單粒谷物特性測(cè)定儀測(cè)定，硬度指數(shù)是無(wú)量綱單位，硬度值大于60為硬質(zhì)，小于40為軟質(zhì)，40～60為混合麥。樣品用量為100～300粒。

濕面筋含量和面筋指數(shù)利用瑞典Perten公司生產(chǎn)的2200型面筋洗滌儀進(jìn)行測(cè)定，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14608-93進(jìn)行，結(jié)果換算成14%濕基條件下的面筋含量。重復(fù)2次。

粉質(zhì)儀參數(shù)利用德國(guó) Brabender公司生產(chǎn)的810104型電子粉質(zhì)儀，按AACC 54-21方法測(cè)定吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、斷裂時(shí)間、粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)等面團(tuán)流變學(xué)特性參數(shù)。結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析。重復(fù)2次。

SDS沉淀值采用張曉等［11］開(kāi)發(fā)的微量法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)2次。

各類(lèi)品質(zhì)參數(shù)按抗病系組群和感病系組群進(jìn)行方差分析，因用于品質(zhì)測(cè)定的2個(gè)組群至少有1組樣本量不足30，故采用兩尾t測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Microsoft excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系細(xì)胞學(xué)與分子標(biāo)記鑒定

隨機(jī)選擇遺傳穩(wěn)定的抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系各5個(gè)，對(duì)各品系RTC進(jìn)行GISH鑒定。結(jié)果顯示，抗病系RTC的GISH圖像中均出現(xiàn)一對(duì)整臂易位染色體，外源染色體臂末端呈現(xiàn)較強(qiáng)雜交信號(hào)，為6VS末端特征GISH-帶紋，表明攜帶Pm21基因的T6VS.6AL易位染色體為純合狀態(tài)(圖1a)。考查感病系RTC制片的GISH圖像，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)簇毛麥染色體(圖1b)，說(shuō)明T6VS.6AL易位染色體的存在與否直接導(dǎo)致了姊妹系間的抗性差異。

利用簇毛麥6VS染色體末端 EST-STS標(biāo)記6VS-381對(duì)抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示所有抗病品系均含有6VS染色體特異的381 bp擴(kuò)增條帶，而所有感病品系均沒(méi)有該擴(kuò)增條帶(圖2)，說(shuō)明姊妹系間的抗感差異來(lái)自6VS的存在與否，這與GISH鑒定結(jié)果一致。由于簇毛麥6VS染色體在小麥背景中不發(fā)生重組，6VS-381可用于小麥遺傳背景中T6VS.6AL易位染色體的分子標(biāo)記追蹤。

圖1 抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系的GISH鑒定Fig.1 Cytogenetic identification of powdery mildew resistant and susceptible sib-lines of wheat by GISH

圖2 抗、感白粉病姊妹系的分子標(biāo)記鑒定Fig.2 Identification of powdery mildew resistant and susceptible wheat sib-lines by molecular marker

2.2 抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系主要農(nóng)藝參數(shù)比較

對(duì)抗病系組群和感病系組群各農(nóng)藝參數(shù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較，u測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明:抗病系千粒質(zhì)量、株高、穗長(zhǎng)和旗葉長(zhǎng)度均極顯著高于感病品系;抗病系的每穗小穗數(shù)顯著高于感病品系，但小穗密度極顯著低于感病品系(表1)。

比較抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系的每穗粒數(shù)、每株穗數(shù)、單株總粒數(shù)和株系產(chǎn)量，均未發(fā)現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明T6VS.6AL易位對(duì)上述性狀沒(méi)有顯著不良影響。

表1 抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系主要農(nóng)藝參數(shù)的u測(cè)驗(yàn)結(jié)果Table 1 U-test of agronomic traits between resistant and susceptible wheat sib-lines

2.3 抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系的品質(zhì)性狀比較

對(duì)抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系組群進(jìn)行各類(lèi)品質(zhì)參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，在SRC、硬度、濕面筋含量、SDS沉淀值、蛋白質(zhì)含量以及所有粉質(zhì)儀參數(shù)中，僅蔗糖SRC和硬度2個(gè)指標(biāo)在抗、感姊妹系間差異達(dá)顯著水平(表2)。盡管抗病系硬度顯著低于感病系，但二者均屬于偏軟質(zhì)小麥類(lèi)型，說(shuō)明T6VS.6AL易位對(duì)硬度的影響有限。在4種SRC中，僅蔗糖SRC在抗、感組群間差異達(dá)顯著水平?？傮w來(lái)看，T6VS.6AL易位不會(huì)影響小麥品質(zhì)類(lèi)型。

表2 抗、感白粉病姊妹系的主要品質(zhì)參數(shù)t測(cè)驗(yàn)結(jié)果Table 2 T-test of quality traits between resistant and susceptible wheat sib-lines

3 討論

本研究利用高代姊妹系組群比較方法，系統(tǒng)分析了T6VS.6AL易位對(duì)小麥主要農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的影響。研究發(fā)現(xiàn)，T6VS.6AL易位對(duì)千粒質(zhì)量的提高作用明顯，增幅高達(dá)9.3%，近似于一個(gè)主基因效應(yīng)，這有利于提高品種的商品性，這是繼抗白粉病性狀之后T6VS.6AL易位在產(chǎn)量要素方面的一個(gè)重要利好。在育種實(shí)踐中，通過(guò)合理的選擇，育種家有可能做到在保持穗數(shù)、粒數(shù)兩要素持平的前提下適當(dāng)增加千粒質(zhì)量，達(dá)到增產(chǎn)的目的。

株高是小麥的重要性狀，一般而言，高稈品種抗倒性不及矮稈品種。研究結(jié)果顯示，T6VS.6AL易位對(duì)株高有極顯著正向效應(yīng)，但增幅較小(3.0%)。因此，當(dāng)以株高為80～90 cm的推廣品種為輪回親本時(shí)，這樣的增幅是完全可以接受的。其次，由于株高的數(shù)量性狀特征，影響株高的QTL位點(diǎn)在雙親間存在多樣性，人工選擇的介入可以有效培育株高與輪回親本相似或更低的新品種。

T6VS.6AL易位對(duì)小麥旗葉長(zhǎng)度也具有極顯著正向效應(yīng)且增幅較大(11.2%)，這可能會(huì)影響群體的通風(fēng)透光。在育種實(shí)踐中，育種家更傾向于篩選旗葉短窄挺立的材料，以增強(qiáng)群體的通風(fēng)透光性。本試驗(yàn)組合中由于最后一個(gè)輪回親本寧麥9號(hào)葉型寬大披散，加上T6VS.6AL易位對(duì)葉長(zhǎng)的增效作用，使得在揚(yáng)麥18原始群體中篩選理想葉型更為困難。因此，在利用T6VS.6AL易位系進(jìn)行滾動(dòng)回交育種時(shí)，應(yīng)盡可能選擇劍葉相對(duì)挺拔短窄的小麥品種作為最晚輪回親本。

T6VS.6AL易位對(duì)小穗密度具有極顯著負(fù)向效應(yīng)而對(duì)每穗小穗數(shù)有顯著正向效應(yīng)，但這種效應(yīng)并沒(méi)有反映在每穗粒數(shù)上。每株穗數(shù)、單株總粒數(shù)以及株系產(chǎn)量在抗、感組群間差異不顯著，說(shuō)明T6VS.6AL易位對(duì)產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響。綜上所述，在高產(chǎn)育種中選擇的作用不容忽視。

在品質(zhì)方面，T6VS.6AL的顯著性效應(yīng)僅體現(xiàn)在蔗糖SRC值的提高和硬度的降低，對(duì)蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、SDS沉淀值、粉質(zhì)儀參數(shù)(面團(tuán)形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間)等均沒(méi)有顯著影響，這不同于Li等［4］的研究結(jié)果。本研究中，蔗糖SRC和硬度2個(gè)指標(biāo)在抗白粉病、感白粉病組群間差異雖達(dá)到顯著水平，但不足以影響小麥品質(zhì)類(lèi)型，抗白粉病姊妹系、感白粉病姊妹系均屬偏軟質(zhì)小麥類(lèi)型。因此，在育種實(shí)踐中，相較于品質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)更重視T6VS.6AL易位對(duì)農(nóng)藝參數(shù)的影響。

在滾動(dòng)回交育種時(shí)，輪回親本的選擇尤為重要。早世代輪回親本在育成品種中所占基因組份額小，晚世代輪回親本在育成品種中所占基因組份額大，因此更應(yīng)重視對(duì)晚世代輪回親本的選擇。本研究中，寧麥9號(hào)作為晚世代輪回親本，與早世代輪回親本揚(yáng)麥158相比，具有結(jié)實(shí)性更好、穗數(shù)更多、產(chǎn)量更高和抗黃花葉病等優(yōu)勢(shì)，這些有利性狀均通過(guò)晚世代回交選育快速固定于新品種揚(yáng)麥18中。由于T6VS.6AL易位對(duì)于株高和葉長(zhǎng)有不利影響，建議選擇中矮稈、葉型相對(duì)短窄挺拔、豐產(chǎn)性和廣適性較好的品種作為較晚世代輪回親本。同時(shí)還應(yīng)注意避免過(guò)度回交，有限回交將為選擇留下較大空間，為在導(dǎo)入供體目的基因的前提下育成品種(系)的綜合農(nóng)藝性狀全面超越輪回親本提供可能。

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