豬APOBEC3F基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在MARC145細(xì)胞中的表達(dá)定位

孟春花， 王春玲， 李靜心， 李隱俠， 朱前明， 曹少先

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物品種改良與繁育重點實驗室，江蘇 南京210014;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3F(Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme cayalytic polypeptide 3F，APOBEC3F)屬于細(xì)胞胞嘧啶脫氨酶家族的重要成員，為固有免疫系統(tǒng)中的一個重要蛋白，包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A～APOBEC3G以及AID(活化誘導(dǎo)脫氨酶)等11個成員［1-2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)APOBEC家族蛋白對包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)［2-4］、泡沫病毒(Foamy virus，PFV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)［5］等多種病毒具有抑制或超突變作用，是具有廣譜抗病毒活性的天然免疫分子［1-6］。APOBEC3F對病毒復(fù)制的抑制作用可以利用其胞嘧啶脫氨基酶活性，通過DNA、RNA編輯途徑和非編輯途徑將HIV、HBV復(fù)制過程中cDNA或RNA上的胞嘧啶(C)突變?yōu)槟蜞奏?U)，也可使5′甲基胞嘧啶(5′mC)轉(zhuǎn)化為5′甲基尿嘧啶(5′mU)，引起從G到A的超突變，從而產(chǎn)生大量致死突變，如色氨酸密碼子TGG突變?yōu)榻K止子TAA，降低病毒的復(fù)制效率［7-9］。但APOBEC3F是否在豬體內(nèi)具有抗病毒作用未見報道。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)俗稱“豬藍(lán)耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引發(fā)，已在全世界范圍內(nèi)引起養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失［10］。PRRSV的增殖對細(xì)胞有嚴(yán)格的選擇性，MARC145細(xì)胞是猴胚胎腎上皮細(xì)胞，近年來常用于體外增殖PRRSV。本研究擬構(gòu)建含增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescence protein，GFP)的真核表達(dá)載體pEGFP-APOBEC3F，并轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞，檢測APOBEC3F蛋白在MARC145細(xì)胞中的表達(dá)、定位，為體外研究APOBEC3F對PRRSV的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體和細(xì)胞

MARC145細(xì)胞、大腸桿菌菌株Top10為本實驗室保存，pEGFP-CMV載體(圖1)由本實驗室構(gòu)建; MARC145細(xì)胞培養(yǎng)條件為:DMEM培養(yǎng)液添加10%胎牛血清和100 mmol/L的谷氨酰胺，胰蛋白酶消化傳代。

圖1 pEGFP-CMV質(zhì)粒圖譜Fig.1 The profile of plasmic pEGFP-CMV

1.2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基、Trypsin/EDTA、胎牛血清、Opti-MEM、LipofectaminTMLTX Reagent、PLUSTMReagent、Trizol等試劑購自Invitrogen公司，DMSO為Sigma公司產(chǎn)品，M-MLV Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，各種限制性內(nèi)切酶和PrimeSTAR?HS DNA Ploymerase購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，快速膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自南京卡羅登生物科技有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 APOBEC3F基因的克隆

取-80℃保存的二花臉豬脾臟，Trizol法提取豬脾臟組織總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)GenBank中豬APOBEC3F cDNA序列(DQ974647.1)，利用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計引物，擴增豬APOBEC3F cDNA。引物序列如下:上游引物5′-GG AGATCTGGGCTCTTCCTACATGG-3′(下劃線部分為BglⅡ酶切位點);下游引物5′-GTCGACGGAACTGTCTGTCATCTCGA-3′(下劃線部分為SalⅠ酶切位點)，由上海英濰捷基生物公司合成。

PCR反應(yīng)體系為20.0 μl，包括5×Primer star緩沖液4.0 μl，dNTP mix 1.6 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5μl，cDNA模板2.0 μl，Primer star聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，以及ddH2O 11.2 μl。反應(yīng)程序:98℃10 s，59℃退火5 s，72℃延伸80 s，共40個循環(huán);72℃延伸10 min。目的片段大小約1 350 bp。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照卡羅登DNA純化回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，所得PCR產(chǎn)物用T4 DNA連接酶與pMD19-T載體連接為pMD-APOBEC3F，然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，在含有氨芐青霉素抗性的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌落搖菌。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后，陽性克隆菌液送上海美吉生物科技有限公司測序。

1.4 APOBEC3F表達(dá)載體構(gòu)建

將pEGFP-CMV載體和測序驗證后的pMD-APOBEC3F分別用BglⅡ和SalⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段DNA。將回收的片段用T4 DNA Ligase連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，取轉(zhuǎn)化好的菌液鋪板在含氨芐青霉素的LB平板上，于37℃靜置培養(yǎng)12 h左右，挑取單克隆，培養(yǎng)菌液提取質(zhì)粒，用BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，命名為 pEGFP-APOBEC3F。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的觀察

MARC145細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18～24 h，細(xì)胞匯合至80%左右時，用脂質(zhì)體LTX介導(dǎo)pEGFP-APOBEC3F，pEGFP-CMV轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞，對照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果［11］。

1.6 APOBEC3F基因表達(dá)水平的Q-PCR檢測

分別于轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h和72 h收集pEGFP-APOBEC3F、pEGFP-CMV轉(zhuǎn)染組及對照組的MARC145細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。DNase I處理后，參照TaKaRa公司試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計合成APOBEC3F基因的Q-PCR檢測引物:上游引物5′-CGGAACCGCTCCTACATC-3′;下游引物5′-GGAACTGAGCCACCTTCG-3′。實時熒光定量PCR參照TaKaRa大連寶生物公司的SYBR Green試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20.0 μl，包括SYBR Green Mix 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA模板2.0 μl，ROX 0.4 μl，以及ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)程序:95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)通過7500 Software v 2.0.5軟件分析。

1.7 APOBEC3F蛋白的細(xì)胞免疫化學(xué)檢測

吸去MARC145細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，用0.2%TritonX-100處理10～15 min，然后用1%BSA封閉1 h，加入兔來源單克隆抗APOBEC3F抗體(1∶100倍稀釋)于4℃孵育過夜;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100倍稀釋)，37℃孵育1 h;室溫下DAB顯色0.5～3.0 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察，棕色為APOBEC3F陽性區(qū)域。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件one-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 APOBEC3F基因的克隆

APOBEC3F基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示約1 300 bp(圖1)，大小與預(yù)期相符合。

圖1 APOBEC3F基因的PCR擴增Fig.1 Amplification of APOBEC3F gene by PCR

2.2 pMD-APOBEC3F質(zhì)粒的鑒定和測序

擴增后的APOBEC3F片段與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，從抗性平皿上挑取陽性菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液(圖2)送上海美吉生物公司測序。經(jīng)測序分析，獲得的APOBEC3F序列與參考序列一致。

圖2 pMD-APOBEC3F質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identification of plasmid pMD-APOBEC3F by PCR

2.3 pEGFP-APOBEC3F的酶切鑒定及測序

對陽性質(zhì)粒用BglⅡ和SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定，可得到2個片段(圖3)，片段大小與預(yù)計相符。經(jīng)測序，獲得的APOBEC3F序列與參考序列一致。

圖3 pEGFP-APOBEC3F的酶切鑒定Fig.3 Identification of plasmid pEGFP-APOBEC3F by restriction endonucleaes digestion

2.4 pEGFP-APOBEC3F在MARC145中的轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡下觀察到MARC145細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-APOBEC3F和pEGFP-CMV 24 h后有綠色熒光(圖4A)，對照組細(xì)胞未見綠色熒光(圖4B)。轉(zhuǎn)染后48 h pEGFP-APOBEC3F組轉(zhuǎn)染效率為82.9%，略低于pEGFP-CMV轉(zhuǎn)染組(84.4%)，兩組差異不明顯。

2.5 APOBEC3F在MARC145細(xì)胞中的表達(dá)水平變化

Q-PCR結(jié)果顯示，MARC145細(xì)胞中APOBEC3F mRNA水平在pEGFP-APOBEC3F轉(zhuǎn)染后24 h達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢;轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-CMV組和未轉(zhuǎn)染陰性對照組中APOBEC3F cDNA的表達(dá)水平極顯著低于轉(zhuǎn)染pEGFP-APOBEC3F組(P＜0.01)。

圖4 pEGFP-APOBEC3F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞Fig.4 Transfection ofplasmid pEGFP-APOBEC3F in MARC145 cells

圖5 APOBEC3F基因在MARC145細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Expression of APOBEC3F gene in MARC145 cells

2.6 APOBEC3F蛋白在MARC145中的表達(dá)、定位

細(xì)胞免疫化學(xué)檢測表明，pEGFP-APOBEC3F轉(zhuǎn)染組MARC145細(xì)胞中APOBEC3F蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，pEGFP-CMV轉(zhuǎn)染組MARC145細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)APOBEC3F蛋白的表達(dá)(圖6)。

圖6 APOBEC3F蛋白在MARC145中的表達(dá)定位Fig.6 Cellular localization of APOBEC3F in MARC145 cells

3 討論

APOBEC3F具有廣譜的抗病毒活性，可有效抑制HIV、HBV、PREV等病毒的復(fù)制，在宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，因此受到廣泛關(guān)注［1-6，12-17］。APOBEC3F含N端模體脫氨基作用較弱，主要與APOBEC分子衣殼化、RNA結(jié)合及二聚體的形成有關(guān)，C端脫氨基模體是其發(fā)揮脫氨基作用的主要活性區(qū)域，但兩者都是發(fā)揮脫氨基功能必不可少的部分［18-20］。APOBEC3F的作用機制是通過gag蛋白［19］、病毒RNA［20］、細(xì)胞RNA［21］的媒介進(jìn)入成熟病毒粒子的核心，并在隨后感染的靶細(xì)胞中使新合成的負(fù)鏈cDNA發(fā)生C→T突變，從而導(dǎo)致新合成的DNA降解或產(chǎn)生大量致死性的G→A突變來抑制病毒的復(fù)制與感染［22-25］。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是傳染性極強的的反義正鏈RNA病毒，可以造成仔豬死亡和妊娠母豬流產(chǎn)及死胎、木乃伊胎。目前，PRRS的防控尚無理想方法，因為PRRSV滅活疫苗免疫后不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)抗體，弱毒活疫苗也只能保護(hù)同種毒株的感染，而PRRSV變異很快。宿主自身免疫能力對該病毒的復(fù)制具有重要抑制作用，因此篩選抗PRRSV能力強的個體進(jìn)行抗性選育是PRRS防控的重要途徑，可以從根源上解決PRRS防控難的問題。我們的前期研究結(jié)果表明:APOBEC3F的外顯子8及內(nèi)含子6的SNP與豬抗PRRS的能力顯著相關(guān)，提示APOBEC3F可能與豬對PRRSV的易感性/抗性相關(guān)［26］。MARC145細(xì)胞是PRRSV在豬體外增殖的常用細(xì)胞系，本研究成功構(gòu)建了APOBEC3F的真核表達(dá)載體并研究了其在MARC145細(xì)胞中的表達(dá)，對研究APOBEC3F對PRRSV的作用，以及探索豬PRRSV抗性差異的機制和抗PRRSV豬的選育具有重要意義。

Jonsson［16］的研究發(fā)現(xiàn)偶蹄動物牛、羊和豬APOBEC3F主要定位在細(xì)胞質(zhì)，并能抑制HIV-1和MLV的 復(fù) 制。本 研 究 中，APOBEC3F轉(zhuǎn) 染MARC145細(xì)胞后也主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，這與Jonsson等的研究結(jié)果一致。本研究中使用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，是一種常用的表達(dá)外源基因的方法，這種方法具有結(jié)果可靠、重復(fù)性好、便于操作等特點，而且所攜帶的DNA片段大小不受限制［27］。本研究中采用的脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞系MARC145細(xì)胞的條件為本實驗室建立的成熟體系［11］，在該體系中pEGFP-APOBEC3F的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到82.9%，且基本沒有細(xì)胞因為轉(zhuǎn)染死亡，而電穿孔法轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率較高，病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法存在安全風(fēng)險［11］。

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