基于NP基因的新城疫病毒Class I實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法的建立及驗(yàn)證

曹軍平， 王曉泉， 程 漢， 劉曉文， 劉秀梵

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

新城疫(Newcastle disease，ND)是唯一分布于五大洲的OIE A類傳染病。中國(guó)ND疫情十分嚴(yán)重，是養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展最直接的威脅［1］，已給家禽生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［2］。

新城疫病毒(NDV)是新城疫的病原，屬禽副粘病毒1型(AMPV-1)，有囊膜，基因組為單股負(fù)鏈RNA，大小約15 kb，編碼6種蛋白質(zhì)，包括RNA聚合酶(L)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白質(zhì)(HN)、融合蛋白質(zhì)(F)、基質(zhì)蛋白質(zhì)(M)、磷蛋白質(zhì)(P)和核蛋白質(zhì)(N)。新城疫病毒分離株根據(jù)對(duì)雞致病嚴(yán)重程度可分為3個(gè)主要致病型(毒力型)［2］:Lentogenic株是低致病力型，可造成雞輕微呼吸道或腸道感染;Mesogenic株是中等致病力型，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病;Velogenic株是高致病力型，造成高死亡率，基于病理表現(xiàn)被進(jìn)一步分為嗜神經(jīng)或嗜內(nèi)臟型。高毒力型NDV屬于必須報(bào)告的OIE A類傳染病，它的發(fā)生可導(dǎo)致檢疫和貿(mào)易禁運(yùn)。

NDV只有1個(gè)血清型，但根據(jù)親緣關(guān)系可以劃分為兩大類:Class I、Class II，絕大多數(shù)常見(jiàn)的都是Class II，可分成Ⅰ～Ⅹ10個(gè)基因型。Class I于2006年被證實(shí)存在，當(dāng)前可被細(xì)分為9個(gè)基因型(1～9)。Class I所有自然分離株均為無(wú)毒株或弱毒株，但有經(jīng)人工傳代返強(qiáng)的報(bào)道，由于其分布廣泛，數(shù)量龐大，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)有巨大的潛在威脅［3］。為了更好地了解Class I新城疫毒株的生物學(xué)特性，為研究Class I提供參考，建立一種快速特異的檢測(cè)方法很有必要。

目前，用雞胚進(jìn)行病毒分離，然后用新城疫特異性抗體做血凝抑制試驗(yàn)代表病毒檢測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)［4］。雖然病毒分離是一個(gè)敏感和特異性的方法，但由于NDV毒力差異大，低毒和無(wú)毒株普遍存在，加之弱毒疫苗的普遍使用，對(duì)分離毒株血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果必須結(jié)合毒力鑒定才能確診，一般需要數(shù)天才能完成［1］。更快速毒力分型方法基于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序，限制性內(nèi)切酶分析擴(kuò)增產(chǎn)物以及使用熒光探針［2］。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RRT-PCR)技術(shù)，靈敏度高，特異性好，避免了傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)后處理步驟，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間和材料［2，4-6］。本研究擬建立針對(duì)禽新城疫病毒Class I核衣殼蛋白(NP)基因的RRTPCR檢測(cè)方法，為快速定量檢測(cè)Class I新城疫病毒及進(jìn)一步明確該病毒對(duì)禽的致病作用和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒

雞新城疫病毒(NDV)由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室(BSL-3)分離鑒定和保存(表1)。所有NDVs分別以磷酸鹽緩沖液(PH 7.2) 10-5倍稀釋接種于9～10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種后24 h內(nèi)死亡雞胚舍棄，及時(shí)收集24～120 h死亡雞胚尿囊液，-70℃保存?zhèn)溆?。禽流感病?AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊炎病毒(IBDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞痘病毒(FPV)等常見(jiàn)禽病病毒均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院保存。

1.2 主要試劑和儀器

TaqMan Universal PCR Master Mix Kit為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;7300型實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上5株Class I NDV NP基因序列，結(jié)合揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離鑒定測(cè)序的8株Class I NDV NP基因序列，GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1，選取保守區(qū)(靠近5′端)設(shè)計(jì)引物。采用LASERGENE軟件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)和分析引物，合成NDV的1對(duì)特異引物及相應(yīng)的探針，并在NCBI上進(jìn)行了BLAST比對(duì)驗(yàn)證。擴(kuò)增片段位于NDV Class I國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)分離株DE-R49-99 NP基因的800～1 086 bp，長(zhǎng)度為287 bp，探針位于 NP基因 970～990 bp。上游引物:5′-CCTCAACTTATTACAACCTC-3′(800～819 bp);下游引物:5′-TACAGATGCCATACCCATTGC-3′(1 066～1 086 bp);TaqMan探針:5′-CGGATGAAAGGGGAGAATGCC-3′(970～990 bp)。5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是 JOE，3′端標(biāo)記的熒光猝滅基團(tuán)為T(mén)AMRA，探針命名為:CNPIP。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備

1.4.1 NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建 NP基因保守區(qū)764 bp(JS-18-05株［7］)陽(yáng)性重組質(zhì)粒由曹軍平構(gòu)建鑒定并保存，載體為 PCR2.1(Invitrogen，USA)。常規(guī)法提取質(zhì)粒純化后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，以確定沒(méi)有變異。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋 用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒在260 nm和280 nm處的吸光度，并根據(jù)公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1 ml分子拷貝數(shù)(個(gè))=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量

DNA分子量=DNA堿基數(shù)×324.5

DNA質(zhì)量濃度=260 nm吸光度×50×稀釋倍數(shù)×6.02×1023

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用引物擴(kuò)增NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒，分別以10倍拷貝系列稀釋的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品模板，加入探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(ABI公司)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)總體積為25 μl。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中檢測(cè)熒光信號(hào)，分別對(duì)引物和探針濃度、循環(huán)參數(shù)、樣本用量等進(jìn)行優(yōu)化。利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

特異性試驗(yàn):以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常見(jiàn)其他禽病病毒及NDV Class II核酸(表1)和健康雞組織 RNA、水為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。

靈敏度試驗(yàn):將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立并計(jì)算靈敏度。

重復(fù)性試驗(yàn):批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，即分別取等量的3份不同滴度(1 μl 102拷貝、104拷貝、106拷貝)的重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每份樣品做5個(gè)重復(fù);批間重復(fù)性試驗(yàn):取以上3份樣品，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行5次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

用表1毒株接種 SPF雞胚，收集尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)(Hemagglutination test，HA)和NDV血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibition test，HI)，同時(shí)用樣品做RRT-PCR試驗(yàn)，計(jì)算2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)多個(gè)批次的重復(fù)試驗(yàn)，證明在25 μl體系中，探針濃度為 0.5 μmol/L、引物濃度為 0.5 μmol/L、模板量3 μl，退火溫度為60℃時(shí)，本底反應(yīng)最小、Ct值最小、擴(kuò)增效率最高。將25 μl體系小心放入RRT-PCR儀中，記錄樣本擺放順序，在96孔板內(nèi)填寫(xiě)被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、定量標(biāo)準(zhǔn)品孔，設(shè)置反應(yīng)程序。95℃預(yù)變性10 min，然后95℃ 15 s，60℃ 1 min，43個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)的收集及數(shù)據(jù)的采集定在60℃。將以10倍拷貝系列稀釋的重組NP基因陽(yáng)性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品模板，加入體系中。檢測(cè)結(jié)束，根據(jù)噪音情況設(shè)定和調(diào)整基線及閾值，并利用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)熒光曲線和循環(huán)數(shù)(Ct)判斷結(jié)果。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件 ，取1 μl 102、103、104、105、106、107、108拷貝濃度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，分別加入RRT-PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，系統(tǒng)自動(dòng)分析軟件顯示Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系(圖1、圖2)。

2.3 特異性試驗(yàn)

以AIV、EDS76、IBDV、IBV、ILTV、FPV等常見(jiàn)其他禽病病毒及NDV Class II核酸(表1)和健康雞組織RNA、水為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效擴(kuò)增。NDV Class I光信號(hào)明顯。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

從圖1可見(jiàn)，當(dāng)1 μl標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度≥1.0拷貝數(shù)時(shí)仍可出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。從圖2可見(jiàn)，在較廣的范圍內(nèi)(1 μl 1.0×102～1.0×108拷貝數(shù))，Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2=0.99。將其檢測(cè)限的Ct值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成初始模板拷貝數(shù)約為1 μl 1拷貝，相當(dāng)于1個(gè)NDV顆粒。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):分別取等量的3份不同滴度(1 μl 102拷貝、104拷貝、106拷貝)的重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每份樣品做5個(gè)重復(fù);批間重復(fù)性試驗(yàn):取以上3份樣品，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行5次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為0.43%～0.99%，批間變異系數(shù)為0.95%～1.39%(表2)，表明誤差都非常小，重復(fù)性好。

表1 NDV標(biāo)準(zhǔn)參考分離株及其他禽病病毒株Table 1 NDV standard reference isolates and other avian viruses isolates

圖1 熒光定量RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Dynamic curve of real-time fluorescent quantitative RTPCR

圖2 RRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of real-time RT-PCR

2.6 驗(yàn)證結(jié)果

RRT-PCR與病毒分離結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示，2種方法檢測(cè)33株NDV，陰性和陽(yáng)性結(jié)果完全符合，符合率為100%。

表2 用熒光定量RT-PCR檢測(cè)3份不同病毒含量標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)和批間重復(fù)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Intra-and inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative RT-PCR for 3 standard samples

3 討論

本研究的目的是制定一個(gè)快速﹑實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)和區(qū)分禽臨床樣本中所有的新城疫病毒。眾所周知，由于新城疫病毒基因組序列之間的高異質(zhì)性［6］，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增每個(gè)新城疫病毒分離株的PCR引物，已被證明存在一些困難［7］。大多數(shù)努力集中于F基因［7］。

將熒光定量RT-PCR應(yīng)用于新城疫病毒的檢測(cè)已有報(bào)道。Mark等［2］建立了RRT-PCR技術(shù)檢測(cè)鳥(niǎo)類臨床標(biāo)本新城疫病毒。檢測(cè)采用單管水解探針，引物和探針根據(jù)M基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)，可檢測(cè)到大約1 000拷貝病毒基因組RNA和10 EID50病毒。Beate等［8］建立了高通量的檢測(cè)外來(lái)NDV的RRTPCR方法。Mia等［9］建立了基于新城疫病毒L基因基礎(chǔ)上的RRT-PCR技術(shù)，對(duì)Mark等建立的新城疫病毒M基因RRT-PCR是一個(gè)有力的補(bǔ)充。Sheau等［10］報(bào)道 NP基因相對(duì)比 F基因更保守。劉曉文［11］研究結(jié)果表明Class I分離株NP基因之間氨基酸序列的同源性為93.0%～99.5%，Class I毒株與 Class II毒株 NP蛋白質(zhì)同源性為 88.2%～92.5%。本研究選取Class I NP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，首次建立了一種新的基于NP基因的檢測(cè)新城疫病毒Class I的RRT-PCR方法，對(duì)Mark等建立的新城疫病毒M基因RRT-PCR也是一個(gè)重要的補(bǔ)充。這兩個(gè)方法結(jié)合可以快速檢測(cè)所有Class I和Class II新城疫病毒并進(jìn)行初步分群。隨著NDV分子生物學(xué)研究的不斷深入，NDV基因序列及功能得到不斷的揭示，ND分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)將得到進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。

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