鵝輸卵管TLR家族基因差異表達的研究

應(yīng)詩家， 戴子淳，2， 郭佳佳， 李 輝， 雷明明， 施振旦， 沈明君

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095;3.揚州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司，江蘇 揚州 225000)

禽類輸卵管的傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部在種蛋形成過程中具有重要的作用，其陰道部和泄殖腔特有的生理結(jié)構(gòu)極易導(dǎo)致糞便中的病原微生物經(jīng)陰道沿輸卵管腔感染輸卵管其他部位［1］。此外，種鵝的賴水習性也極易引起養(yǎng)殖水體病原微生物通過交配進入種鵝生殖道，誘發(fā)輸卵管炎癥反應(yīng)，影響種蛋受精率和孵化率［2-3］。因此，種鵝輸卵管自身的非特異性免疫功能對抵御病原微生物侵害至關(guān)重要。

Toll樣受體(TLRs)是一類病原識別模式受體，識別病原微生物及其代謝產(chǎn)物，啟動胞內(nèi)信號級聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)，抵御病原微生物侵染［4-5］。已發(fā)現(xiàn)的禽類TLR家族包括TLR1-1、TLR1-2、TLR2-1、TLR2-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21共10個基因［6］。這些TLRs的時空表達對識別病原微生物，啟動非特異性免疫反應(yīng)，維持組織器官功能具有重要的作用。Ozoe等對 TLR1-1、TLR1-2、TLR2、TLR3、TLR14、TLR5和TLR7的研究發(fā)現(xiàn)TLR1-1在輸卵管各部位均不表達，TLR2、TLR3和TLR14在陰道、子宮和傘部組織表達顯著高于膨大部［7］。華國洪和劉少豐等分別研究了鵝TLR2-1和TLR15［8］、TLR3和TLR5［9］基因在皮膚、脾臟和法氏囊等11種組織器官中的差異表達。然而，國內(nèi)外對鵝輸卵管TLR家族基因的研究尚無報道。

本試驗擬系統(tǒng)地研究已發(fā)現(xiàn)的10種禽TLR家族基因在產(chǎn)蛋高峰期種鵝輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部的表達變化，為種鵝輸卵管啟動非特異性免疫反應(yīng)，抵御病原微生物侵染的分子調(diào)控機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在揚州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司所屬的瑞農(nóng)農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社隨機選擇5只產(chǎn)蛋高峰期揚州鵝，產(chǎn)蛋后8 h(新生蛋運行至子宮部［10］)頸動脈放血屠宰，取輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部以及脾臟組織樣，液氮保存。

1.2 主要試劑

100 bp Marker和 PrimeScriptTMRT Master Mix購自寶生物工程(大連)有限公司，Taq PCR Master Mix購自南京博爾迪生物科技有限公司，astStart U-niversal SYBR Green Master購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，含Dase I的RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取小塊傘部、峽部、膨大部、子宮部、陰道部和脾臟組織，按天根試劑盒說明書提取總RNA。RNA質(zhì)量檢測合格后，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)體系為10.00 μl(2.00 μl 5×PrimeScript? Buffer，8.00 μl RNA)。反轉(zhuǎn)錄程序:37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

1.5 PCR反應(yīng)和測序

根據(jù)GenBank登錄號，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，其中TLR1-1、TLR1-2和TLR21的引物根據(jù)鴨相應(yīng)的序列信息設(shè)計，引物信息見表1，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為10.00 μl:2×Taq PCR Master Mix 5.00 μl，ddH2O 3.50 μl，上游和下游引物各0.25 μl，RT產(chǎn)物1.00 μl。

反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，50/57/60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán); 72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

表1 定量PCR引物信息Table 1 Primer pairs used for real-time PCR

1.6 Real-time PCR分析

以管家基因β-actin為內(nèi)參，每個樣品重復(fù)3次，取平均Ct值進行計算，所得試驗數(shù)據(jù)按2-△△Ct結(jié)果統(tǒng)計分析。

定量PCR反應(yīng)體系為20 μl:1.00 μl RT產(chǎn)物，上游引物和下游引物各0.60 μl，7.80 μl ddH2O，10.00 μl FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)。反應(yīng)程序為:50℃2 min，95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，50/57/60℃退火30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值 ±標準誤”表示。試驗數(shù)據(jù)采用單因子方差分析，Duncan法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝輸卵管TLRs家族基因表達譜

分別采用設(shè)計的引物進行RT-PCR擴增，并以脾臟的擴增產(chǎn)物為陽性對照，PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果與欲擴增目的片段大小一致(圖1)。通過測序，并與GenBank已登錄的序列(表1)比對，相似性達到97%以上，表明PCR擴增片段為鵝TLR家族基因片段。

基因表達試驗結(jié)果(圖1)顯示，目前已發(fā)現(xiàn)的禽類10種TLR家族基因均在鵝輸卵管中表達，除膨大部未發(fā)現(xiàn)TLR1-1表達和子宮部組織未發(fā)現(xiàn)TLR5表達外，輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部均表達其他TLR家族基因。

圖1 鵝輸卵管和脾臟TLR1-1家族基因表達譜Fig.1 Gene expression profiling of Toll-like receptors in geese oviduct and spleen tissues

2.2 鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達

鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達見表2。TLR2-2和TLR21在輸卵管傘部、峽部、膨大部、子宮部和陰道部表達差異不顯著(P＞0.05);TLR1-1、TLR3、TLR5和TLR15 4個基因在陰道部高表達;TLR14和TLR5 2個基因在峽部高表達;TLR1-2和 TLR2-1 2個基因在傘部高表達; TLR2-1和TLR7分別在膨大部和子宮部中高表達。

陰道部TLR1-1表達顯著高于傘部(P＜0.05)，TLR3表達顯著高于傘部、峽部和膨大部 (P＜0.05)，TLR5表達顯著高于傘部和膨大部 (P＜0.05)，TLR15表達顯著高于子宮部(P＜0.05);傘部TLR1-2和TLR2-1表達顯著高于峽部和陰道部(P＜0.05);峽部TLR14表達顯著高于子宮部和陰道部 (P＜0.05)，TLR5顯著高于傘部和膨大部(P＜0.05);膨大部TLR2-1表達顯著高于峽部和陰道部(P＜0.05);子宮部TLR7表達顯著高于傘部、峽部、膨大部和陰道部(P＜0.05)。

表2 鵝TLR家族基因在輸卵管不同功能部位的差異表達Table 2 Differential expression of TLRs gene in all segments of geese oviduct

3 討論

非特異性免疫反應(yīng)是機體抵抗感染性疾病的第一道屏障，而TLR家族基因是非特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因［11-12］，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁［13］。目前已發(fā)現(xiàn)禽類TLR家族包含10種基因，其中大多數(shù)基因在禽類卵巢［6］、輸卵管［7］和睪丸［14］中表達，參與性腺免疫反應(yīng)，維持性腺功能穩(wěn)態(tài)。本試驗系統(tǒng)研究了10種TLR家族基因在鵝輸卵管不同功能部位的差異表達，結(jié)果顯示禽類10種TLR家族基因均在鵝輸卵管中表達，表明鵝輸卵管存在抵御病原微生物侵染的非特異性免疫反應(yīng)。與雞輸卵管的研究結(jié)果類似［7］，TLR1-1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR7均在輸卵管各個功能部位表達，TLR5在鵝輸卵管的子宮部不表達。TLR5具有識別細菌鞭毛蛋白的功能［15］，因此，本試驗的結(jié)果也表明家禽和水禽輸卵管非特異性免疫反應(yīng)存在種間差異，并且鵝輸卵管子宮部識別細菌鞭毛蛋白的能力可能弱于雞的子宮。

禽類的輸卵管極易受多種病原微生物感染，如沙門氏菌［16-17］、支氣管炎病毒［18］和禽流感病毒［19］等，而TLR家族基因可識別廣泛的病原微生物及其代謝產(chǎn)物［20］。研究結(jié)果表明TLR1可識別肽聚糖、脂磷壁酸、阿拉伯糖甘露糖脂及酵母和真菌的酵母多糖［15］;TLR2除具有TLR1的識別功能外還可識別革蘭氏陰性菌釋放的LPS［15］;TLR3識別雙鏈RNA，同時可以感受到dsRNA病毒、SSRNA病毒和DNA病毒的感染［15，21］;TLR4識別革蘭氏陰性菌釋放的LPS［6，7，22］;TLR5識別細菌鞭毛蛋白［15］;TLR7識別單鏈RNA［15］;TLR15識別革蘭氏陰性菌;TLR21識別細菌基因組產(chǎn)生的未甲基化CpG DNA序列［20］。因此，鵝輸卵管不同功能部位表達大多數(shù)TLR家族基因，可有效識別各類病原微生物及其代謝產(chǎn)物，啟動非特異性免疫反應(yīng)。本試驗中，TLR家族的4個基因在陰道部高表達，2個基因分別在峽部和傘部高表達，僅1個基因在膨大部和子宮部高表達，說明鵝輸卵管的兩端部位識別病原微生物的能力最強。

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