陳暉 ，方華 ，張怡評 ，陳偉珠 ，洪專 ，易瑞灶

(1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005；

2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室，福建廈門 361005)

海藻糖是一種分子結(jié)構(gòu)明確的天然二糖，由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基以α–1，1糖苷鍵結(jié)合，其二水合物分子式為C12H22O11·2H2O，相對分子質(zhì)量為378.33。海藻糖無毒性，水溶性好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。近年來，國內(nèi)外的眾多研究表明海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，國際上用它作為生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，在保護(hù)基因工程酶類、各種病毒、疫苗、抗體、蛋白質(zhì)因子、核酸等方面都取得了很好的結(jié)果，在食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥、分子生物化學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景［1］。

目前國內(nèi)外高度重視海藻糖在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)利用，已有食用級海藻糖和藥用輔料級海藻糖在市場上銷售使用，但是國內(nèi)未見海藻糖國家標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報道及銷售，使得國內(nèi)對海藻糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制及藥理藥效學(xué)研究完全依賴于昂貴的進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)樣品［2］，限制了對海藻糖的深入研究。筆者以食品級海藻糖粗品為原料，純化制備了海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，解決了海洋天然活性物質(zhì)中結(jié)構(gòu)近似的糖類化合物難以分離的共性技術(shù)問題，對加速海藻糖活性的理論研究與應(yīng)用基礎(chǔ)研究、促進(jìn)海洋生物醫(yī)藥的發(fā)展具有積極的推動作用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離 子 色 譜 儀：ICS 3000型，美 國Thermo Scientifi c公司；

紅外光譜儀：VERTEX 70型，美國Bruker公司；質(zhì)譜儀：3100型，美國Waters公司；

核磁共振儀：400 MHz，美國Bruker公司；

單晶衍射儀：SuperNova型，美國Agilent公司；天平：AL／104型，瑞士Mettler Toledo公司；純水機(jī)：Milli-Q型，美國Milli-pore公司；

氫氧化鈉溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，美國Thermo Scientifi c公司。

1.2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

以食品級海藻糖粗品為原料，經(jīng)熱溶冷析結(jié)晶、乙醇結(jié)晶、減壓干燥等方式獲得純度不低于99%的海藻糖。

1.3 定性分析

采用紅外吸收光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、單晶衍射等對海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

1.4 定值分析

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品含量采用高靈敏度的離子色譜法［3］進(jìn)行測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：CarboPac PA–10柱(250 mm×4 mm，美國 Thermo Scientifi c)；流動相：30 mol／L NaOH溶液；流量：0.8 mL／min；積分安培檢測器，標(biāo)準(zhǔn)4電位檢測；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：30℃。

1.4.2 樣品配制

精密稱取海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品0.150 g，用水溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻后精密移取1 mL至250 mL容量瓶中，定容，搖勻，用0.2 μm微孔濾膜過濾，按照1.4.1色譜條件進(jìn)行純度檢測，進(jìn)樣25 μL。每個樣品重復(fù)進(jìn)樣測定3 次。

1.5 均勻性檢驗

對同一批制備的海藻糖樣品進(jìn)行分裝，每瓶凈重為1 g，共400瓶。按照GB／T 15000.3–2008［4］規(guī)定，確定抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法對海藻糖樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗，測定方法采用離子色譜法，每個樣品重復(fù)測定3次。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

取海藻糖樣品模擬上市包裝，在(40±2)℃，相對濕度為(75±5)%的條件下進(jìn)行24個月長期試驗，分別于 0，3，6，9，12，18，24 個月取樣，采用離子色譜法進(jìn)行檢測，考察其樣品純度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的定性分析

利用紅外吸收光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜以及單晶衍射對海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

圖1、圖2分別是海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外光譜、質(zhì)譜圖。海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的核磁解析數(shù)據(jù)見表1。

圖1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外光譜圖

圖2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜圖

表1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的核磁共振數(shù)據(jù)歸屬(D2O介質(zhì))

由圖1可知，海藻糖結(jié)構(gòu)中存在羥基(—OH)、亞甲基(—CH2)、碳與氧的單鍵連接。樣品質(zhì)譜圖中，在負(fù)離子電噴霧狀態(tài)下測得準(zhǔn)分子離子峰為m／z 341［M–H］+，與其相對分子質(zhì)量(342)相符。此外，在該質(zhì)譜圖中還可見到m／z 179(C6H11O6)和m／z 163(C6H11O5)的少量碎片，與該化合物為兩個六碳糖相連而成的結(jié)構(gòu)相符。

由表1可知，該化合物的各質(zhì)子、各碳的化學(xué)位移與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致，且質(zhì)子數(shù)、碳原子數(shù)與海藻糖的分子式一致。其中，端基質(zhì)子δ5.08 (d，J=4.0 Hz)為耦合常數(shù)4.0 Hz的二重峰，屬于D–葡萄糖的1位質(zhì)子與2位質(zhì)子呈e-a立體關(guān)系，表明為α立體構(gòu)型。由于該分子呈完全對稱的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，表明兩個葡萄糖之間以α，α鍵相連而成［5］。

通過培養(yǎng)獲得海藻糖單晶，選擇大小適度、晶質(zhì)良好的單晶體，利用X–衍射技術(shù)進(jìn)行晶體的測定和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明該化合物為2水合α，α–海藻糖，2分子椅式吡喃型D–葡萄糖均通過端基的α構(gòu)型連接而成，與Liu W等［6］報道一致。

確定海藻糖的結(jié)構(gòu)式(如圖2所示)及晶體結(jié)構(gòu)。

圖2 海藻糖的結(jié)構(gòu)式

2.2 均勻性檢驗

在對海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分裝后，進(jìn)行純度均勻性檢驗，均勻性檢驗結(jié)果見表2、表3。

表2 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品純度均勻性檢驗結(jié)果 %

表3 均勻性檢驗方差分析結(jié)果

由表 3 可知，F(xiàn)=MS組間／MS組內(nèi)≈ 1.84，F(xiàn)(0.05，14，30)=2.04，F(xiàn)＜F(0.05，14，30)，說明在 95% 的置信區(qū)間，海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

2.3 穩(wěn)定性檢驗

因為海藻糖性質(zhì)穩(wěn)定，所以選擇在高溫條件下加速樣品的化學(xué)或物理變化，模擬出樣品在長期儲存條件下的變化，考察樣品的穩(wěn)定性，為樣品的包裝、運輸、存儲提供資料。在40℃條件下24個月內(nèi)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品測定結(jié)果見表4。

表4 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

采用直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，對海藻糖長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［7–8］，計算可得斜率|a|＜t0.95，n-2s(a)，故斜率不顯著，因而未觀測到不穩(wěn)定性，說明在該存儲條件下，海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性良好。參照中國藥典(2010版)［9］的相關(guān)說明，可以將海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期暫定為2年。

2.4 定值結(jié)果及其不確定度評定

2.4.1 定值結(jié)果

按照GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)要求，采用多個實驗室協(xié)作定值，選擇獲得國家或部門認(rèn)可、具備資質(zhì)的8家實驗室對研制的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值。隨機(jī)抽取8瓶樣品，每個定值實驗室送1瓶，采用離子色譜法進(jìn)行測定，應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定量，定值結(jié)果見表5。

表5 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果匯總 %

匯集各家實驗室的檢測數(shù)據(jù)后，對每家實驗室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗組內(nèi)數(shù)據(jù)的異常值，結(jié)果沒有異常值，則所有數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步統(tǒng)計［10］。再用Grubb’s法對每家實驗室的平均值進(jìn)行檢驗，將其看成一組測定值進(jìn)行異常值檢驗，結(jié)果無異常值。因此將各家實驗室測得的數(shù)據(jù)作為無偏估計值，計算8家實驗室測定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后對各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s進(jìn)行Cochran檢驗，按式(1)計算統(tǒng)計量C：

式中：si——各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

smax——si中的最大值。

計算 得 C=0.685，查表得 C8，6(0.05)=0.360，C ＞C8，6(0.05)，表明各實驗室間的測量不屬于等精度測量，因此計算加權(quán)平均值作為最佳值得到海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果(總平均值X=99.72%)。

2.4.2 定值結(jié)果的不確定度評定

根據(jù)GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度u由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗的不確定度u(X)、均勻性檢驗的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度ults組成。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算海藻糖樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

(1)標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗引入的不確定度u(X)。按照加權(quán)法計算得到標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度u(X)=0.08%。

(2)均勻性檢驗引入的不確定度ubb。該項用瓶間方差表示，計算得ubb=0.02%。

(3)穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults。由2.3穩(wěn)定性試驗可以計算得ults=s(a)t=0.09%。

則標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度：取包含因子k=1.96，則擴(kuò)展不確定度：U95=ku=1.96×0.13%=0.26%

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果為(99.72±0.26)%，k=1.96。

3 結(jié)語

研制的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)實驗考察其均勻性、穩(wěn)定性均符合要求，該標(biāo)準(zhǔn)樣品對食品安全、生物醫(yī)藥等方面的測量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證。

［1］ 馬文錦，劉樹興，潘巨忠，等.海藻糖的生產(chǎn)制備及應(yīng)用前景［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007，24: 199–201.

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［3］ 陳暉，易瑞灶，謝榮偉，等.基于離子色譜法的海藻糖檢測方法研究［J］.中國海洋藥物，2012(1): 34–37.

［4］ GB／T 15000.3–2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3) 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法［S］.

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