黃芪甲苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

韓 冬 田耀輝 白慶嶺

（滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001）

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年升高。長(zhǎng)期血糖控制不佳往往導(dǎo)致多個(gè)組織器官并發(fā)癥的發(fā)生，包括肝臟組織損傷。隨著病理生理學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)糖脂代謝異常引發(fā)氧自由基的大量生成與過(guò)剩，而導(dǎo)致的廣泛的氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同機(jī)制之一[1-2]。黃芪甲苷為中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、降血壓、提高機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)活性[3-5]，且近年來(lái)研究者通過(guò)制作糖尿病大鼠模型后實(shí)施黃芪甲苷干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠有效降低糖尿病大鼠血糖水平，提高免疫力，并能有效改善腎臟組織并發(fā)癥[6-7]，但黃芪甲苷是否對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織具有保護(hù)作用，尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將采用高脂高糖飲食飼養(yǎng)8周后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法誘導(dǎo)制備糖尿病大鼠模型，研究黃芪甲苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝臟組織的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠，200～240g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（冀）2008-1-003。于室溫 22～25℃、相對(duì)濕度 60%～70%、光照周期12h∶12h的環(huán)境中飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并進(jìn)行動(dòng)物模型的制備。

1.2 藥物和試劑 黃芪甲苷（成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：140523，純度≥98%）；鹽酸二甲雙胍（河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20131126）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司；STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 主要儀器 血糖儀（羅氏）；UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；卓越310型全自動(dòng)生化分析儀（武漢精誠(chéng)偉業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)SLEE公司）；AL104電子天平（Mettler-Toledo公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組、給藥 實(shí)驗(yàn)用大鼠經(jīng)高糖高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周后，一次性通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg破壞胰島β細(xì)胞制備糖尿病大鼠模型[8]，分別于24h、72h后檢測(cè)空腹血糖水平，穩(wěn)定在16.7mmol/L以上即認(rèn)定為造模成功。取100只造模成功的大鼠根據(jù)血糖水平分為模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量（30、60、120mg/kg）組及鹽酸二甲雙胍（200mg/kg）組[9]，另取20只同齡正常大鼠作為正常對(duì)照組。造模成功后，各治療組通過(guò)灌胃給藥，每日1次，療程4周，模型組和正常對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.2 指標(biāo)檢測(cè) 治療完成后，測(cè)定每組大鼠空腹血糖。每組大鼠隨機(jī)選取10只，稱量體重，隨后腹腔注射烏拉坦實(shí)施麻醉，開腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，檢測(cè)血清中各生化指標(biāo)，然后取肝臟組織，稱重以計(jì)算肝臟指數(shù)，稱重完成后置于4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用于制作石蠟組織切片；每組剩余的10只大鼠，經(jīng)麻醉后開腹取肝臟組織，沖洗干凈后加入適量冷裂解液，研磨勻漿，用于檢測(cè)肝臟組織中抗氧化酶活性和丙二醛含量。具體方法如下：

2.2.1 空腹血糖水平檢測(cè) 大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下由尾靜脈采血，通過(guò)血糖儀測(cè)定空腹血糖。

2.2.2 血 清 中 ALT、AST、ALP活性的檢測(cè) 實(shí)施麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心取血清，然后按照試劑盒要求通過(guò)生化檢測(cè)儀測(cè)定各組大鼠血清中ALT、AST、ALP 活性。

2.2.3 肝臟指數(shù)的計(jì)算及肝臟組織病變的觀察 大鼠麻醉后開腹取肝臟組織，生理鹽水沖洗干凈后稱量肝臟重量，然后計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)（%）=（肝臟重量/體重量）×100%。取稱量完成后的肝組織，行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度約為 5μm） 和展片，常規(guī)HE染色，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肝臟組織病理性形態(tài)學(xué)變化并照相保存。

2.2.4 肝細(xì)胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)的計(jì)算取肝臟組織石蠟切片，按照TUNEL試劑盒操作步驟進(jìn)行染色并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織細(xì)胞凋亡狀況（細(xì)胞核黃染為陽(yáng)性著色）。凋亡指數(shù)的計(jì)算：每張染色切片選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中肝細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)，取平均值，然后計(jì)算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)（%）=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.2.5 肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量的檢測(cè) 取肝臟組織，加入適量冷裂解液后行研磨勻漿，3000r/min低溫（4℃）離心10min后取上清液，按照試劑盒操作方法，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定大鼠肝臟組織SOD、CAT活性和MDA含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以（）表示；計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示具有極顯著差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數(shù)比較 見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠治療后血清ALT、AST、ALP活性比較見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數(shù)比較（）

表1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數(shù)比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 各組大鼠治療后血清中ALT、AST、ALP活性比較（）

表2 各組大鼠治療后血清中ALT、AST、ALP活性比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 各組大鼠肝臟組織病變情況 正常對(duì)照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞均未見(jiàn)異常；模型組大鼠肝臟組織呈現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇充血水腫、肝細(xì)胞空泡變性、胞質(zhì)著色不均、胞核固縮等明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)黃芪甲苷治療4周后，肝臟組織病變明顯改善，其中以高劑量組效果最為顯著。見(jiàn)圖1。

3.4 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡狀況及凋亡指數(shù)比較 正常對(duì)照組大鼠肝臟組織僅存在極其少量的凋亡細(xì)胞；模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增高；經(jīng)黃芪甲苷治療4周后，實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡狀況明顯改善，以高劑量組效果最為顯著，見(jiàn)圖2。計(jì)算凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），而經(jīng)黃芪甲苷中、高劑量治療4周后，實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表 3。

3.5 各組大鼠肝臟中 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較 見(jiàn)表4。

4 討論

長(zhǎng)期血糖控制不佳的晚期糖尿病患者常伴有多個(gè)組織器官的并發(fā)癥，其危害往往高于糖尿病本身，是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的主要原因，包括肝臟組織并發(fā)癥。隨著病理生理學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)糖脂代謝紊亂導(dǎo)致氧自由基大量生成與過(guò)剩，引發(fā)廣泛的氧化應(yīng)激損傷及其繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同病理機(jī)制之一[10-11]。Khaki A等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物干預(yù)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠抑制糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)展。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理性形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，×400）

表3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（）

表3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量（mg/kg）正常對(duì)照組凋亡指數(shù)（%）102.1±1.210黃芪甲苷低劑量組 10 30 28.5±6.1黃芪甲苷中劑量組 10 60 22.7±4.0*黃芪甲苷高劑量組 10 120 15.3±3.2**鹽酸二甲雙胍組 10 200 24.9±4.6*模型組 37.4±6.9△△

表4 各組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量（）

表4 各組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量（）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量（mg/kg）CAT（U/mg prot）14.1±2.0 SOD（U/mg prot）10 GSH-Px（U/mg prot）正常對(duì)照組MDA（nmol/mg prot）19.3±2.9 4.08±0.973.71±0.7910黃芪甲苷低劑量組 10 30 9.7±1.9 14.2±2.6 2.61±0.90 8.62±1.80模型組 9.2±1.5△△ 13.6±2.1△△ 2.46±0.82△△ 9.48±1.65△△黃芪甲苷中劑量組 10 60 10.5±2.2* 14.8±3.0 3.15±0.97* 7.94±1.56*黃芪甲苷高劑量組 10 120 11.8±2.3** 16.5±2.9** 3.46±1.13** 5.73±1.37**鹽酸二甲雙胍組 10 200 10.4±2.0* 14.5±2.7 2.78±0.84 6.48±1.51**

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，味甘性微溫，具有斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、降血壓、提高機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)活性。鹽酸二甲雙胍是目前常用的降糖口服藥，能夠通過(guò)增強(qiáng)胰島素敏感度、促進(jìn)葡萄糖利用和抑制肝糖原異生，表現(xiàn)出降糖作用，且對(duì)糖尿病誘發(fā)的肝、腎、血管等并發(fā)癥具有抑制作用，所以本研究選擇鹽酸二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

細(xì)胞膜在氧自由基的攻擊下極易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而生成丙二醛（MDA），所以肝組織中MDA的含量能夠間接反映肝組織氧化應(yīng)激損傷程度；超氧化物歧化酶（SOD）被稱為機(jī)體防御氧自由基損傷的第一道屏障，它能夠催化還原氧自由基生成過(guò)氧化氫[12]，并在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的催化作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人體無(wú)害的水和氧[13]。血清中ALT、AST、ALP活性是臨床上常用的監(jiān)測(cè)肝功能的生化指標(biāo)，肝細(xì)胞膜受損后，導(dǎo)致ALT、AST、ALP迅速釋放入血而使血清中三者活性陡然增高，因此能夠敏感地反映肝功能受損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飲食飼養(yǎng)8周后腹腔注射STZ的方法誘導(dǎo)制備的糖尿病大鼠模型，并以鹽酸二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照藥物進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)黃芪甲苷60、120mg/kg干預(yù)4周能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠空腹血糖水平，增加大鼠體重并降低肝臟指數(shù)，抑制肝臟組織病變及肝細(xì)胞凋亡，且能顯著提高肝臟組織中SOD、CAT活性并降低MDA含量，同時(shí)降低血清中ALT、AST活性；黃芪甲苷高劑量能顯著升高模型大鼠肝臟組織中GSH-Px活性，降低血清ALP活性。提示黃芪甲苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝臟組織具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其能夠有效降低血糖水平、改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、改善肝功能有關(guān)。除肝臟組織外，長(zhǎng)期血糖控制不佳還可能誘發(fā)腎臟、心肌、腦等多個(gè)組織器官的并發(fā)癥，下一步我們將研究黃芪甲苷是否對(duì)糖尿病誘發(fā)的其他組織器官并發(fā)癥具有保護(hù)作用。

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