王艷+苗立中+付強+莊金秋+沈志強

摘要：為進一步了解鴨疫里默氏桿菌的生長特性，本研究利用改良酵母肉湯培養(yǎng)基運用正交設計的方法，在10L的小型發(fā)酵罐中對鴨疫里默氏桿菌各種發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。隨后將優(yōu)化結果在GMP生產(chǎn)車間，利用200L大型發(fā)酵罐規(guī)?；嚿a(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原進行驗證，結果顯示，鴨疫里默氏桿菌活菌數(shù)比優(yōu)化前提高30%，為鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;發(fā)酵條件;大罐發(fā)酵

中圖分類號：S858.325.1+2 ? ? ?文獻標識碼：B ? ? ?文章編號：1673-1085（2014）05-0036-04

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer RA）感染是全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病。該病以病鴨死亡率高、消瘦、胴體淘汰、品質下降等造成巨大經(jīng)濟損失[1]。迄今為止，該病的防治主要有藥物防治及疫苗接種兩種方法[2]，作為預防鴨疫里默氏桿菌病的有效措施，疫苗正在得到廣泛的應用[3]。在疫苗的制備過程中，菌體的濃度直接關系到疫苗質量的好壞和免疫保護效果。所以改善RA的培養(yǎng)條件，提高有效成分濃度對制苗非常重要。高密度發(fā)酵作為近年來新興產(chǎn)業(yè)，可有效提高抗原產(chǎn)量和培養(yǎng)基的利用率，大幅度降低生產(chǎn)成本，顯著縮短生產(chǎn)周期，減少勞動強度，提高生產(chǎn)效率[4]，為鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的生產(chǎn)提供了一種新的有效可行的抗原制備工藝。本研究旨在通過鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化達到菌液濃度最大化的目的，為研制高效疫苗打好基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗用菌株 ?菌株來源：鴨疫里默氏桿菌JX-2株，血清Ⅱ型，分離自北京金星鴨場病死鴨，并由山東綠都生物科技公司菌種室保存。

1.1.2 ?發(fā)酵培養(yǎng)基 ?改良酵母肉湯：大豆蛋白胨5g，水解乳蛋白8g，20%酵母浸液50ml，氯化鈉1.5g，豬胃消化液100ml，加蒸餾水至1000ml;116℃高壓滅菌20min，使用前加入5%馬血清。

1.1.3 ?主要儀器和試劑 ?SBA-40E型雙光束紫外分光光度計（Cecil）;GUJS-10C型和GUJS-200C型發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物）;SHZ-82A型氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大）;消泡劑;豆油。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種復蘇 ?取凍干保存的鴨疫里默氏桿菌JX-2株，用2ml馬丁肉湯稀釋、混勻，接種于改良酵母肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24h，取樣劃線接種于改良酵母固體培養(yǎng)基平板，置厭氧罐中，37℃培養(yǎng)18～24h，再挑選符合標準的典型菌落用改良酵母固體培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

1.2.2 ?發(fā)酵細菌種子液的制備 ?用改良酵母肉湯洗下純培養(yǎng)菌落，按2%種子量接種于120ml改良酵母肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24h，經(jīng)純粹檢驗合格后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗方案設計

1.2.3.1 ?正交試驗 ?運用正交試驗設計[4]的方法，將影響鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵的條件分為通氣（L/S.L）、轉速（轉/min）、培養(yǎng)基pH值等，并將各條件分別設置3個水平，具體試驗分組見表1。

1.2.3.2 ?發(fā)酵 ?上述分組試驗均在37℃條件下，培養(yǎng)基為改良酵母肉湯，分別按照上述試驗條件各自發(fā)酵，發(fā)酵罐采用10L容量，發(fā)酵液為6000ml，分別采集發(fā)酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的發(fā)酵液，進行活菌計數(shù)及OD450nm值檢測。

1.2.4 ?優(yōu)化配方和優(yōu)化工藝在GMP生產(chǎn)車間規(guī)?；a(chǎn)應用 ?根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結果，在GMP生產(chǎn)車間規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原，發(fā)酵罐采用200L，發(fā)酵液體積為150L，分別采集發(fā)酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h發(fā)酵液，進行活菌計數(shù)和OD450nm值檢測，查看規(guī)模化應用效果。

1.2.5 ?發(fā)酵液檢測

1.2.5.1 ?活菌計數(shù) ?按中華人民共和國獸藥典2010年版三部進行。即將發(fā)酵不同時間樣品分別進行10-1～10-10系列稀釋，然后取合適的稀釋度接種改良酵母瓊脂平板，每個稀釋度接種3個平板，0.1ml/板，置蠟燭罐中，37℃培養(yǎng)24h，進行菌落計數(shù)，3個平板上菌落的平均數(shù)即為該稀釋度的細菌數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)即為該菌液的細菌濃度。

1.2.5.2 ?OD450nm值測定 ?取不同發(fā)酵時間樣品，應用紫外分光光度計對其OD450nm值進行測定，并記錄數(shù)據(jù)以進行比較。

2 ?結果

2.1 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時間各組CFU測定結果見表2。以108CFU為縱坐標，生長時間為橫坐標，分別繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時間的生長曲線（見圖1）。

由表2及圖1可見，正交試驗組別序號2獲得的菌液活菌數(shù)最高，在發(fā)酵18h可達2.87×1010cfu/ml。此組發(fā)酵條件是通氣0.1L/S.L;轉速150r/min;培養(yǎng)基pH值7.4。

2.2 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時間各組OD450nm值測定結果見表3。以OD450nm值為縱坐標，生長時間為橫坐標，分別繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時間的OD450nm值變化曲線（見圖2）。

由表3及圖2可見，正交試驗組別序號2獲得的菌液濃度最高，在發(fā)酵22h，OD450nm值可達6.37，測定結果與菌液活菌數(shù)測定結果相一致。

2.3 ?RA JX-2株在發(fā)酵不同時間各批次活菌數(shù)及OD450nm值測定結果見表4。分別以活菌數(shù)及OD450nm值為縱坐標，生長時間為橫坐標，繪出RA JX-2株在發(fā)酵不同時間的生長曲線（見圖3、圖4）。

從表4、圖3、圖4可見，20130803批次取得的菌液濃度及活菌數(shù)目最高，分別為6.47、2.96x1010cfu/ml，20130801批次和20130802批次取得的菌液濃度及活菌數(shù)目分別為6.34、2.92x1010cfu/ml和6.43、2.83x1010cfu/ml。

3 ?分析與討論

3.1 ?利用高密度發(fā)酵培養(yǎng)的方式，RA在18h時菌液活菌數(shù)達到高峰，較搖床培養(yǎng)到達菌數(shù)高峰時間要提前6個小時左右，且活菌數(shù)也提高了60%多[5]，由此可見高密度發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)越性。

3.2 ?從GMP生產(chǎn)車間規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原的菌液濃度及活菌數(shù)目來看，3批發(fā)酵檢測數(shù)值非常穩(wěn)定，獸用生物制品GMP車間利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝大規(guī)模發(fā)酵鴨疫里默氏桿菌的效果和實驗室試驗結果基本相同，可以大規(guī)模推廣應用。

3.3 ?根據(jù)培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化結果，在GMP生產(chǎn)車間規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)3批鴨疫里默氏桿菌抗原活菌數(shù)均達到了280億/ml以上，而優(yōu)化之前活菌數(shù)最高是200億/ml，優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了約30%，這大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。

3.4 ?在高密度發(fā)酵過程中，我們采用活菌計數(shù)及OD450nm值測定2種方法進行培養(yǎng)菌液的菌液濃度測定，以此來確立2種檢測方法的相關性，在以后的生產(chǎn)中可通過測定RA發(fā)酵液的OD450nm值來推算其活菌數(shù)，這樣不但可以避免活菌計數(shù)的繁瑣操作，且可更加及時地得知培養(yǎng)結果，大大提高了生產(chǎn)效率。

3.5 ?本研究通過提高發(fā)酵工藝，優(yōu)化其工藝參數(shù)，提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率，不僅可以減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期、提高設備利用率從而降低生產(chǎn)成本，達到提高生產(chǎn)效率的目的。這對工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)鴨疫里默氏桿菌抗原提供了理論依據(jù)并具有一定實用價值。

參考文獻：

[1] ?Y.M.Saif.禽病學[M].第十二版，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012，893-901.

[2] ?蔡家利，蘇小運，唐曉麗，等.鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗比較研究[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2001，23（4）：270-273.

[3] ?寧玲忠，雷紅宇，胡仕鳳，等.鴨疫里默氏菌病研究進展[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2013，175（3）：4-5.

[4] ?劉吉山.鴨疫里默氏菌2型制苗菌株的篩選及高密度發(fā)酵[D].中國農(nóng)業(yè)大學，2006，1-2.

[5] ?苗立中.副豬嗜血桿菌熒光定量PCR方法建立及其分離株高密度發(fā)酵研究[D].吉林大學，2012，46-47.