張依裕，李萬(wàn)貴，王單單

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025)

番鴨CYP7A1基因多態(tài)性對(duì)肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)的效應(yīng)研究

張依裕，李萬(wàn)貴，王單單

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025)

CYP7A1是催化動(dòng)物肝臟膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸的限速酶。本研究采用PCR-SSCP法和DNA直接測(cè)序相結(jié)合篩查白羽番鴨CYP7A1基因多態(tài)性，分析其與肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明:在CYP7A1基因外顯子2檢測(cè)到沉默突變c.294.A＞G，產(chǎn)生3種基因型AA、AG和GG，AG和A分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率分別為0.5517和0.6107;在外顯子3檢測(cè)到沉默突變c.759.T＞A，TT和T分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率分別為0.6552和0.7931;2個(gè)SNP均為中度多態(tài)位點(diǎn)，且基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡。關(guān)聯(lián)分析顯示，c.294.A＞G突變對(duì)肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響;c.759.T＞A突變對(duì)血清總膽固醇、總蛋白和白蛋白有顯著效應(yīng)，A為低血清總膽固醇的有利等位基因，可能作為降低番鴨膽固醇的一個(gè)標(biāo)記性輔助選擇位點(diǎn)。

番鴨;CYP7A1基因;SNP;肉質(zhì);血清生化指標(biāo)

肝臟膽汁酸合成的代謝途徑是一個(gè)精細(xì)的調(diào)控過(guò)程,它對(duì)膳食中脂質(zhì)吸收和血清中的膽固醇調(diào)控是不可或缺的,在哺乳動(dòng)物的進(jìn)化中這一調(diào)控過(guò)程存在差異。膽固醇7a羥化酶(CYP7A1)在維持膽固醇體內(nèi)平衡過(guò)程中扮演著重要角色,是催化肝臟膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸的限速酶,在嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)中,它的活性與血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)呈負(fù)相關(guān),并證實(shí)CYP7A1活性的下降導(dǎo)致血清LDL-C水平上升而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)［1］。CYP7A1功能的發(fā)揮主要受其轉(zhuǎn)錄水平的控制,受晝夜節(jié)律、生活壓力、有害異物、膽固醇、膽汁酸等效應(yīng)因子的調(diào)節(jié),肝細(xì)胞核因子4α(HNF-4)、胎蛋白轉(zhuǎn)錄因子(FTF)、微小異源二聚體伴侶基因(SHP)、過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1)等核激素受體共同參與了這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程［2］。研究證明,大鼠中核激素受體肝X受體α(LXR)正向調(diào)控CYP7A1的表達(dá)量,而人類(lèi)CYP7A1基因啟動(dòng)子區(qū)缺乏LXR結(jié)合位點(diǎn)而沒(méi)有呈現(xiàn)出類(lèi)似調(diào)控作用,這對(duì)研究膽固醇代謝的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在物種進(jìn)化中的差異有重要意義［3-4］。至目前為止,CYP7A1基因的研究主要集中在小鼠和人類(lèi)上的研究報(bào)道,在家禽上的研究報(bào)道較少。為了進(jìn)一步了解家禽CYP7A1基因的遺傳效應(yīng),本研究以白羽番鴨為研究素材,采用PCRSSCP法結(jié)合DNA測(cè)序檢測(cè)CYP7A1基因部分編碼區(qū)的多態(tài)性,分析其多態(tài)對(duì)肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)的影響,為今后開(kāi)展番鴨的標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 同批出雛的白羽番鴨母鴨100只飼養(yǎng)于貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院金沙縣水禽養(yǎng)殖基地,飼養(yǎng)管理水平一致,10周齡時(shí)隨機(jī)抽取58只禁食12 h,自由飲水,心臟采血,自然凝固后分離血清用于生化指標(biāo)測(cè)定,分離血清后的血液凝集物用于DNA提取,宰后取胸肌用于肉質(zhì)測(cè)定。2×Taq Master Mix、TIANamp Blood DNA KIT試劑盒、二甲苯氰及其他常規(guī)試劑均購(gòu)自恒因生物有限公司。

1.2 肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)測(cè)定 采用Au5800型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼儀器公司)測(cè)定總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯和總膽固醇;胸肌采后即用張依裕等［5］報(bào)道的方法測(cè)定胸肌常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)pH值、失水率、嫩度和肌內(nèi)脂肪(IMF)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)家鴨CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增白羽番鴨CYP7A1基因外顯子2和3,引物信息見(jiàn)表1。

表 引物序列

表 引物序列

引物 序列(5′→3′) 擴(kuò)增區(qū)域及片段大小/bp 退火溫度/℃CYP2 F:AGG AGA GCC ACC ACT TGA AA 外顯子,2165～324/160 58 R:GGG GTC AGT GAG GAA ATG AA CYP3-1 F:GGT AGC ATT GAC CCA GCA GA 外顯子,3412～697/286 60 R:TCT CGG TTT CCT GCT TTG ATA CYP3-2 F:AGG AAA CCG AGA GAG CAC ATA T 外顯子,3686～983/298 60 R:GTA GCA GGA ATG GTG TTA GC

1.4 基因組DNA提取 采用TIANamp Blood DNA KIT試劑盒提取所有白羽番鴨個(gè)體的基因組DNA, 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度,調(diào)整其終濃度為100 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR-SSCP分型 用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物分別對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)總體積為20 μL∶2× Taq Master Mix 8 μL,dd H2O 9 μL,10 μmol/μL正、反向引物各1 μL,100 ng/μL DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程度均為94℃預(yù)變性10 min;94℃變性45 s,退火30 s,72℃延伸45 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)電泳進(jìn)行檢測(cè)。

移液槍取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6 μL上樣緩沖液(98%甲酰胺、2%甘油、0.025%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、5 mmol/L EDTA)混合,98℃變性15 min,-80℃放置3 min,電壓150 V條件下在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=39∶1)上電泳8 h,銀染顯色,隨機(jī)選取不同帶型個(gè)體(3個(gè))的PCR產(chǎn)物直接送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 DNAMAN軟件和人工較對(duì)相結(jié)合篩查SNP位點(diǎn),PopGen v1.32軟件計(jì)算基因型和等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。SPSS 17.0軟件對(duì)位點(diǎn)基因型與各性狀值間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Duncan′s法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn),結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測(cè) 通過(guò)對(duì)引物CYP2、CYP3-1和CYP3-2的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)電泳檢測(cè),結(jié)果表明PCR產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符,條帶清楚、單一,達(dá)到SSCP分型要求。通過(guò)SSCP分型,引物CYP3-1的擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有檢測(cè)到多態(tài),引物CYP2和CYP3-2中均檢測(cè)到3種帶型,CYP2的帶型定義為AA、AG和GG,CYP3-2的帶型定義為T(mén)T、AT和AA,圖譜見(jiàn)圖1。

2.2 SNP篩查 通過(guò)DNAMAN軟件和人工較對(duì)相結(jié)合篩查番鴨CYP7A1基因SNP位點(diǎn),比對(duì)結(jié)果顯示,在CYP2座位檢測(cè)到1個(gè)SNP,位于家鴨CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)294位的A→G突變(c.294.A＞G),處于外顯子2內(nèi),位于CDS區(qū)的216位,為沉默突變;在CYP3-2座位也檢測(cè)到1個(gè)SNP,位于家鴨CYP7A1基因mRNA序列(JQ922243)759位的T→A突變(c.759.T＞A),該突變處于外顯子3內(nèi),位于CDS區(qū)的681位,為沉默突變(見(jiàn)圖2)。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜

圖2 序列比對(duì)圖

2.3 SNP位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率 由表2可知,c.294.A＞G位點(diǎn)中AG和A分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因,其頻率分別為0.5517和0.6107;c.759.T＞A位點(diǎn)中TT和T分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因,其頻率分別為0.6552和0.7931;2個(gè)SNP位點(diǎn)均表現(xiàn)為中度多態(tài)位點(diǎn),且基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡(＞0.05)。 2.4 SNP位點(diǎn)與番鴨肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析 由表3可知,c.294.A＞G位點(diǎn)對(duì)所測(cè)肉質(zhì)和血清生化指標(biāo)的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平(＞0.05),但表現(xiàn)出純合子AA基因型個(gè)體的失水率低于純合子GG基因型個(gè)體,其他指標(biāo)則高于純合子GG基因型個(gè)體;c.759.T＞A位點(diǎn)純合子TT基因型個(gè)體的血清總膽固醇、總蛋白和白蛋白顯著高于純合子AA基因型

表2 2個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率

表3 CYP7A1基因?qū)Π子鸱喨赓|(zhì)和血清生化指標(biāo)的影響

個(gè)體(P＜0.05),雜合子AT基因型個(gè)體總膽固醇和白蛋白顯著高于純合子AA基因型個(gè)體(P＜0.05),雜合子AT基因型個(gè)體總膽固醇顯著高于純合子TT基因型個(gè)體(P＜0.05),其他基因型個(gè)體性間差異未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

3 討 論

在人類(lèi)的研究中表明,人類(lèi)疾病如肝硬化、動(dòng)脈粥樣性硬化、腦血栓等及其對(duì)藥物的治療反應(yīng)與CYP7A1基因多態(tài)性存在相關(guān)性,同時(shí)多種核受體與CYP7A1組成轉(zhuǎn)錄抑制/激活網(wǎng)絡(luò),維持體內(nèi)膽汁酸和脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡［6］。在動(dòng)物界的研究中,對(duì)大鼠和小鼠CYP7A1的研究報(bào)道較多［7］,但在家禽上的報(bào)道極少。蘭旅濤等［8］運(yùn)用同源序列克隆結(jié)合RACE技術(shù)首次報(bào)道了鴨CYP7A1基因cDNA序列,該基因在肝臟中呈高豐度表達(dá),在其他組織中表達(dá)量極低,表明該基因的表達(dá)具有組織特異性。楊堃［9］通過(guò)RACE法獲得了鵝CYP7A1基因序列,該基因在超飼養(yǎng)條件下其表達(dá)受到抑制。李萬(wàn)貴等［10-11］采用PCR-SSCP和DNA直接測(cè)序技術(shù)在興義鴨CYP7A1基因外顯子3檢測(cè)到5個(gè)同義突變的SNPs∶G744A、G783A、T858C、C951G和G960A,它們對(duì)血清白蛋白、球蛋白和總蛋白有顯著效應(yīng);在櫻桃谷鴨CYP7A1基因編碼區(qū)87～246 bp區(qū)域檢測(cè)到c.129C＞T沉默突變,該突變對(duì)肌內(nèi)脂肪和血清總膽固醇產(chǎn)生顯著影響,但這一突變沒(méi)有在金定鴨和興義鴨中檢測(cè)到。

本研究首次對(duì)番鴨CYP7A1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了c.294.A＞G和c.759.T＞A 2個(gè)SNP,均為沉默突變,2個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量均處于0.25～ 0.5,按Botstein等［12］劃分標(biāo)準(zhǔn),均為中度多態(tài)座位。研究表明,高度多態(tài)最有利于群體遺傳分化,中度多態(tài)次之,低度多態(tài)則不易于群體遺傳分化［13］,因此,2個(gè)SNP位點(diǎn)在番鴨育種中對(duì)于群體遺傳分化上是較為有利的。關(guān)聯(lián)分析顯示,c.294.A＞G位點(diǎn)對(duì)研究中所測(cè)性狀沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響,c.759.T＞A位點(diǎn)對(duì)血清總膽固醇、總蛋白和白蛋白有顯著效應(yīng)。在人類(lèi)和小鼠的研究中表明,CYP7A1與膽固醇含量呈負(fù)相關(guān),CYP7A1的活性有利于膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化,對(duì)膽固醇引起的相關(guān)疾病有重要調(diào)節(jié)作用［14］。同時(shí),潘蘭兵等［15］報(bào)道,血清中總膽固醇、總蛋白和白蛋白呈正相關(guān)。因而,c.759.T＞A位點(diǎn)可能作為選擇高低膽固醇的2個(gè)分化群體的選擇性標(biāo)記。然而,由于沒(méi)有開(kāi)展c.759.T＞A位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型個(gè)體的表達(dá)比較分析和群體分化等研究,其作為標(biāo)記選擇育種還只是停留在預(yù)測(cè)上。與此同時(shí),樣本數(shù)較少也是制約結(jié)果可靠性的一個(gè)關(guān)鍵因素,特別是c.759. T＞A位點(diǎn)AA基因型和c.294.A＞G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體少,結(jié)果代表性不理想,不能完全肯定或否定c.759. T＞A和c.294.A＞G位點(diǎn)的遺傳效應(yīng),這需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)和更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)加以證實(shí)(如表達(dá)研究等),還需要進(jìn)一步篩查番鴨CYP7A1基因其他區(qū)域的多態(tài)性,進(jìn)行全基因SNP單倍型分析,找到更有利于番鴨育種的單倍型,在提高番鴨的育種進(jìn)程上會(huì)更有意義。

［1］ Wertheim B C,Smith J W,Fang C,et al.Risk modification of colorectal adenoma by CYP7A1 polymorphisms and the role of bile acid metabolism in carcinogenesis［J］.Cancer Prev Res(Phi-la),2012,5(2):197-204.

［2］Kir S,Zhang Y,Gerard R D,et al.Nuclear receptors HNF4and LRH-1cooperateinregulatingCyp7a1invivo［J］.JBiolChem,2012, 287(49):41334-41341.

［3］ Li T,Francl J M,Boehme S,et al.Regulation of cholesterol and bile acid homeostasis by the cholesterol 7-hydroxylase/steroid response element-binding protein 2/microRNA-33a axis in mice［J］.Hepatology,2013,58(3):1111-1121.

［4］Tempel W,Grabovec I,MacKenzie F,et al.Structural characterization of human cholesterol 7-hydroxylase［J］.J Lipid Res,2014, 55(9):1925-1932.

［5］張依裕,李萬(wàn)貴,潘蘭兵,等.興義鴨LPL基因外顯子8多態(tài)性與生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2013,32(5):589-593.

［6］ Lammel Lindemann J A,Angajala A,Engler D A,et al.Thyroid hormone induction of human cholesterol 7 alpha-hydroxylase (Cyp7a1)in vitro［J］.Mol Cell Endocrinol,2014,388(1-2):32-40.

［7］邢萬(wàn)佳,高聆,趙家軍.膽固醇7-羥化酶CYP7A1表達(dá)及調(diào)控相關(guān)研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志,2012,20(16):1439-1446.

［8］ 蘭旅濤,陳昌義,徐琪,等.鴨CYP7A1基因克隆、序列分析及組織表達(dá)研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(6):887-893.

［9］ 楊堃.鵝CYP7A1基因克隆、表達(dá)調(diào)節(jié)及表達(dá)規(guī)律的研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

［10］李萬(wàn)貴,張依裕,潘蘭兵,等.興義鴨CYP7A1基因外顯子3多態(tài)性與血清生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性研究［J］.中國(guó)家禽,2014,36 (2):11-15.

［11］李萬(wàn)貴,張依裕,潘蘭兵,等.鴨CYP7A1基因編碼區(qū)C129T突變對(duì)肉質(zhì)和脂肪性狀的遺傳效應(yīng)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012,(24):158-160.

［12］Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.Am J Hum Genet,1980,32(3):314-331.

［13］毛永江.中國(guó)牛亞科家畜六個(gè)群體遺傳多樣性與遺傳分化及其統(tǒng)計(jì)方法的研究［D］.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2006.

［14］Park W H,Pak Y K.Insulin-dependent suppression of cholesterol 7-hydroxylase is a possible link between glucose and cholesterol metabolisms［J］.Exp Mol Med,2011,43(10):571-579.

［15］潘蘭兵,張依裕,林家棟,等.興義鴨血清生化指標(biāo)和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,(24):96-98.

Effect of the CYP7A1 Gene Polymorphism on Meats Quality and Serum Biochemical Indexes in Muscovy Ducks

ZHANG Yi-yu,LI Wan-gui,WANG Dan-dan
(College of Animal Science,Guizhou University,Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region,Ministry of Education,Guizhou University,Guizhou Guiyang 550025,China)

CYP7A1(cholesterol 7-alpha hydroxy-lase,CYP7A1)is the rate-limiting enzyme produced the bile acid with cholesterol.The research investigated the polymorphism of CYP7A1 gene by PCR-SSCP methods and DNA sequencing in Muscovy ducks,analysis on the correlation with meats quality and serum biochemical index.The results indicated that the silent mutation c.294 A＞G was detected,and it formed 3 genotype AA,AG and GG, AG and A was dominant genotype and allele respectively,the frequency was 0.5517 and 0.6107 respectively.The silent mutation c.759.T＞A was investigated in exon 3,TT and T was dominant genotype and allele respectively,the frequency was 0.6552 and 0.7931 respectively,all of 2 SNPs belonged to moderate polymorphism and genotype distribution located in Hardy-Weinberg equilibrium.The correlation results showed that c.294.A＞G mutation have significant effect on meat quality and serum biochemical levels,c.759.T＞A mutation also have significant effect on total cholesterol,total protein and albumin,A was the beneficial allele for low level serum total cholesterol,which may be a marker assisted site for breeding low cholesterol Muscovy duck.

CYP7A1 gene;meat quality;muscovy duck;serum biochemical level

S834.2

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0005-05

2014-11-19;

2015-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160453);貴州大學(xué)博士基金項(xiàng)目 [貴大人基合字(2010)037]

張依裕(1976-),男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,從事動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用研究,E-mail:zyy8yyc@163.com