張佳娟　綜述，李　平　審校

篩查獻(xiàn)血者丙型肝炎病毒感染研究進(jìn)展

張佳娟綜述，李平審校

【摘要】丙型肝炎病毒（HCV）是一種單股正鏈RNA病毒，全長約9.6 kb，開放讀框區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。全球HCV感染率約為3%，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，在獻(xiàn)血者中進(jìn)行HCV篩查是防控丙型肝炎病毒傳播的最有效手段。目前，檢測(cè)HCV感染的方法主要包括抗HCV抗體檢測(cè)、HCV抗原檢測(cè)、HCV抗原-抗體聯(lián)合檢測(cè)、膠體金法快速檢測(cè)、HCV分子核酸檢測(cè)等?？贵w檢測(cè)應(yīng)用最早，但窗口期較長；抗原檢測(cè)能縮短窗口期，敏感性高，但易受到體內(nèi)因素的干擾而影響檢測(cè)結(jié)果。一些快速檢測(cè)方法不需要任何設(shè)備，且簡便易行，但其敏感性較差。分子檢測(cè)使用的HCV RNA擴(kuò)增技術(shù)（NAT）是目前最敏感的檢測(cè)技術(shù)，能大大縮短窗口期，但其檢測(cè)成本較為昂貴。各檢測(cè)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。目前，血液中心采用至少兩種不同試劑檢測(cè)抗HCV以進(jìn)行血液的安全篩查。

【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒；輸血后肝炎；核酸擴(kuò)增試驗(yàn)；獻(xiàn)血者

輸血治療是臨床上搶救危重患者的重要手段之一，但在輸血過程中存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。由于我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，輸血后肝炎（post-transfusion hepatitis，PTH）已成為現(xiàn)代輸血領(lǐng)域的一個(gè)突出問題。在所有PTH中，90%都和丙型肝炎病毒（Heptitis C Virus，HCV）感染有關(guān)。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的不斷進(jìn)步，HCV檢測(cè)方法已有較大的發(fā)展，制定符合經(jīng)濟(jì)成本和安全保障需求的篩查方案，降低輸血感染HCV風(fēng)險(xiǎn)是一項(xiàng)刻不容緩的任務(wù)。我國現(xiàn)階段HCV抗體檢測(cè)是國家血液篩查的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，膠體金快速檢測(cè)可作為初篩檢測(cè)，HCV RNA核酸檢測(cè)只在部分發(fā)達(dá)地區(qū)的血站試行，而HCV抗原檢測(cè)尚未應(yīng)用于血液篩查。本文就上述幾種HCV檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，以加深對(duì)其認(rèn)識(shí)。

1　HCV概述

1943年Beeson和Morgan最早報(bào)道了部分患者在輸血后出現(xiàn)黃疸［1，2］。黃疸的出現(xiàn)引起學(xué)者對(duì)輸血后感染以及PTH的重視和研究。乙型肝炎病毒（Heptitis B Virus，HBV）是最早發(fā)現(xiàn)和PTH相關(guān)的肝炎病毒，1971年美國政府規(guī)定在獻(xiàn)血者中篩查乙肝表面抗原（HBsAg）［3］，但此后PTH仍時(shí)有發(fā)生，而其中大部分（約75%）都和HBV感染無關(guān)。1973年Feinstone et al發(fā)現(xiàn)了甲型肝炎病毒（Heptitis A Virus，HAV），隨后的研究證明其并不通過輸血感染［4］。1977年柳葉刀雜志上曾報(bào)道新的PTH病原體，但當(dāng)時(shí)未能鑒定出是何種肝炎病毒，于是采用非甲非乙肝炎（non-A，non-B Heptitis，NANBH）這個(gè)概念［5］。直至1989年美國學(xué)者Choo采用分子生物學(xué)技術(shù)成功克隆了HCVcDNA，鑒定為新型肝炎病毒。HCV可通過輸血感染，是PTH的另一主要病原體［6］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3%，每年新感染病例約315萬例［7］，死亡25萬例，占所有傳染病死因的第10位。由于HCV RNA的變異性，短期內(nèi)難以研制出特異性的丙型肝炎疫苗，預(yù)防HCV感染主要通過積極有效的措施來切斷傳播途徑。不同國家報(bào)道獻(xiàn)血者中HCV陽性率從0.4% 到13.3%不等［8～11］，在獻(xiàn)血者中篩查HCV以防控輸血感染尤為重要。

HCV屬于黃病毒科，其基因組為單股正鏈RNA病毒，全長約9.6 Kb，包括5’非編碼區(qū)、開放讀框區(qū)和3’非編碼區(qū)［12］。開放讀框區(qū)編碼長度約3000個(gè)氨基酸的蛋白前體，經(jīng)宿主細(xì)胞基因和病毒基因編碼的蛋白酶切割，成熟為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV基因組的5’端為結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)區(qū)，由C、E1和E2基因組成，分別編碼核心蛋白、包膜蛋白gp33 （E1蛋白）和包膜蛋白gp70（E2蛋白）。核心蛋白含190個(gè)氨基酸，序列十分保守，在 HCV增殖及致病機(jī)制中起重要作用，是HCV感染的重要標(biāo)志。E2蛋白的氨基端有一個(gè)高變區(qū)，可能是中和抗體作用的位點(diǎn)。HCV基因組的3’端為編碼功能蛋白的非結(jié)構(gòu)區(qū)，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4 和NS5。其中NS3蛋白具有蛋白酶功能，NS5蛋白為RNA依賴的RNA多聚酶，分為NS5A和NS5B。NS3、NS4和NS5均能有效的誘導(dǎo)HCV感染者出現(xiàn)抗體應(yīng)答，其中NS3抗體出現(xiàn)最早，但由于其是構(gòu)象依賴性的，使用NS3的合成多肽并不能檢出相應(yīng)的特異性抗體。而NS4區(qū)則含有至少兩個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)序列位點(diǎn)，抗原性較強(qiáng)，絕大多數(shù)HCV感染者能產(chǎn)生針對(duì)該區(qū)C100-3的抗體反應(yīng)［13］。

2　血清HCV抗體檢測(cè)

HCV抗體檢測(cè)主要采用酶免疫分析（EIA）技術(shù)，先后已經(jīng)歷了三代技術(shù)發(fā)展。不同HCV抗體檢測(cè)試劑分別針對(duì)HCV不同結(jié)構(gòu)蛋白的不同表位而設(shè)計(jì)，1989年美國Chiron公司最早利用重組HCV抗原C100-3融合蛋白包被，建立了第一代HCV抗體檢測(cè)方法。第一代方法通常在感染HCV 后12 w～26 w才能檢測(cè)出抗體，存在一個(gè)較長的窗口期［14］。同時(shí)第一代方法只是根據(jù)非編碼抗原NS4區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，其特異性差、靈敏度也較低。第二代HCV抗體檢測(cè)試劑盒于1990年出現(xiàn)，它以HCV基因組非編碼抗原NS3區(qū)的C33C 和NS4區(qū)的融合表達(dá)抗原（C200）再加上C區(qū)的核心抗原C22-3作為固相包被進(jìn)行檢測(cè)。第二代檢測(cè)方法彌補(bǔ)了第一代方法的部分不足，提高了HCV檢測(cè)的敏感性和特異性。研究顯示，其在HCV感染高危人群中的檢出率較第一代檢測(cè)方法提高了5%～40%；在急性輸血后HCV中，較第一代方法提高20%以上；而在慢性HCV感染者中的檢出率也增加了10%以上；同時(shí)抗C33C較抗C100-3出現(xiàn)早30天～90天，可縮短窗口期至10周左右［15］。目前國內(nèi)獻(xiàn)血中心采用的HCV篩查方法，絕大部分用的都是第三代HCV抗體檢測(cè)方法。第三代方法在第二代的基礎(chǔ)上，還結(jié)合了另一個(gè)非編碼抗原NS5，由于同時(shí)檢測(cè)病毒基因組的結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的多個(gè)編碼抗原，不但提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，還使檢測(cè)的窗口期又縮短了1周左右［16］。EIA檢測(cè)抗體技術(shù)具有簡便、快捷等特點(diǎn)，但易受到諸多因素的影響，如類風(fēng)濕因子、高免疫球蛋白血癥、標(biāo)本中超氧化物歧化酶等因素可造成假陽性結(jié)果；而檢測(cè)過程中加樣時(shí)間過長、操作速度過快、洗板等因素可造成假陽性結(jié)果［17］。由于HCV感染到機(jī)體抗體產(chǎn)生有一個(gè)較長的時(shí)期，平均約40天～70天，稱為感染后血清轉(zhuǎn)陽前的窗口期。盡管第三代檢測(cè)技術(shù)已將窗口期縮短至66天左右，但這仍然是威脅輸血安全的重要因素之一。

3　血清HCV抗原檢測(cè)

核心抗原蛋白（Core）的氨基酸序列在不同基因型的HCV氨基酸序列同源性超過95%，是HCV早期感染的重要標(biāo)志。目前HCV抗原檢測(cè)試劑盒主要檢測(cè)HCV的核心抗原，對(duì)HCV核心抗原檢測(cè)有利于HCV早期感染獻(xiàn)血者的發(fā)現(xiàn)，特別是一些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者及某些不產(chǎn)生抗體的攜帶者。一項(xiàng)對(duì)18例HCV抗體陰性，HCV RNA陽性的患者研究發(fā)現(xiàn)，11人（61%）能夠檢測(cè)出HCV核心抗原陽性［18］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)6名HCV RNA陽性，HCV抗體陰性的獻(xiàn)血者中，5例（83%）的獻(xiàn)血者為HCV核心抗原陽性；在135例長期血液透析患者的血清標(biāo)本中，有92例HCV RNA陽性，其中81例（88%）檢測(cè)出核心抗原陽性［19］。目前認(rèn)為HCV核心抗原檢出的平均窗口期為49天，僅僅比HCV RNA晚1天～2天。HCV核心抗原陽性與HCV RNA檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的相關(guān)性，國內(nèi)一項(xiàng)研究報(bào)道：在142例慢性丙型肝炎患者血清中，HCV核心抗原和HCV RNA陽性率分別為45.1%和43.0%，兩種標(biāo)志物均為陽性者58例，均為陰性者75例；HCV RNA陰性血清HCV核心抗原陽性6例，HCV RNA陽性血清HCV核心抗原陰性3例，結(jié)果符合率為93.7%（133/142），核心抗原檢測(cè)和病毒檢測(cè)的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）［20］。一項(xiàng)薈萃25篇文章的meta分析結(jié)果顯示：HCV核心抗原檢測(cè)的敏感性平均約84%（95%CI：0.83-0.85），而特異性可達(dá)到98%（95%CI：0.97-0.98）［21］。HCV抗原檢測(cè)耗時(shí)短，方法與常規(guī)酶免疫實(shí)驗(yàn)相似，不用添加儀器設(shè)備，且大大縮短了窗口期。但是當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)HCV抗體之后，體內(nèi)HCV核心抗原和抗體相結(jié)合，抗原檢出率下降。因此，HCV核心抗原主要應(yīng)用與HCV感染的早期診斷［22］。

4　血清HCV抗原-抗體聯(lián)合檢測(cè)

HCV抗原-抗體（HCV Ag/Ab）聯(lián)合檢測(cè)被認(rèn)為是“第四代”檢測(cè)技術(shù)，近年國內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道使用。該方法主要應(yīng)用夾心酶免疫技術(shù)，在固相和第二層中包被了HCV衍生抗原和HCV抗體。Laperche et al［23］采用Monolisa HCV Ag/Ab聯(lián)合檢測(cè)對(duì)12份HCV RNA和HCV抗原檢測(cè)均陽性、HCV抗體檢測(cè)陰性的樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中有6份樣本檢測(cè)結(jié)果呈陽性。他們還對(duì)發(fā)生HCV抗體陽轉(zhuǎn)的血液透析患者血清標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，在抗體陽轉(zhuǎn)前采集的樣本中，24 份HCV RNA陰性的樣本Monolisa HCV Ag/Ab聯(lián)合檢測(cè)亦呈陰性，59份HCV RNA陽性的樣本中有23份呈陽性；對(duì)于血清HCV抗體陽轉(zhuǎn)后采集的83份樣本中，Monolisa HCV Ag/Ab聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果均呈陽性。Laperche et al隨后對(duì)44份核酸檢測(cè)呈陽性的窗口期標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中31（70.5%）能夠使用Monolisa HCV Ag/Ab檢測(cè)呈陽性。Monolisa HCVAg/Ab聯(lián)合檢測(cè)的窗口期平均為26.8天，平均比核酸檢測(cè)晚5.1天，而聯(lián)合檢測(cè)的特異性能達(dá)到99.88%［24］。另一種聯(lián)合檢測(cè)試劑Murex HCV Ag/Ab同樣具有較高的靈敏度和特異性，報(bào)道稱其窗口期比HCV抗體檢測(cè)方法早14.1天，更比Monolisa HCV Ag/Ab方法早2天左右［25］。

5　快速檢測(cè)

膠體金法快速檢測(cè)技術(shù)從1989年誕生至今，已被廣泛應(yīng)用于免疫檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，這個(gè)方法可以在幾分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并且不需要依賴任何儀器和設(shè)備。HCV膠體金法快速檢測(cè)技術(shù)主要采用特異性抗原抗體反應(yīng)及免疫層析技術(shù)，對(duì)HCV的Core和NS3抗原進(jìn)行標(biāo)記和包被制備檢測(cè)試劑。HCV不同來源的診斷抗原、抗原濃度比例和制備工藝都可能影響試劑的檢測(cè)性能［26］。樣本溶血會(huì)影響膠體金在硝基纖維膜上的層析過程而出現(xiàn)假陰性；非特異性的高IgG對(duì)固相載體具有較強(qiáng)的吸附力，可引起假陽性［27］。來自51個(gè)血液中心的檢測(cè)結(jié)果顯示：快速HCV抗體檢測(cè)的敏感性范圍是47% ～100%［28］。雖然臨床使用中存在一定的假陽性和假陰性，但膠體金法快速檢測(cè)仍可作為篩查HCV抗體的首推方法，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)預(yù)防和控制丙型肝炎具有重要的臨床價(jià)值和應(yīng)用［29］。

6　HCV分子核酸檢測(cè)

HCV感染后基因組的復(fù)制出現(xiàn)較早，感染后數(shù)天即出現(xiàn)病毒血癥，大約1～2周即可檢測(cè)到HCV RNA。HCV RNA是HCV在機(jī)體內(nèi)存在的最直接標(biāo)志，對(duì)其檢測(cè)可大大縮短窗口期。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)（nucleic acid amplification，NAT）是一系列直接檢測(cè)病原體核酸的技術(shù)的總稱，主要是使用一些物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法，通過靶核酸擴(kuò)增的方法，將極微量的核酸轉(zhuǎn)變成直觀的光電或可視信號(hào)，從而判斷是否存在病原體［30］。NAT檢測(cè)技術(shù)主要采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）兩種原理。PCR過程需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）為cDNA，再進(jìn)行DNA擴(kuò)增；而TMA利用T7RNA聚合酶進(jìn)行一系列反應(yīng)，在等溫條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以提高RNA水平到可檢測(cè)的程度。NAT可檢測(cè)出極微量的核酸，大大縮短窗口期，目前已有40多個(gè)國家的血液中心開始使用NAT技術(shù)在獻(xiàn)血者中檢測(cè)HCV，我國也逐步將NAT血液篩查納入新的輸血技術(shù)操作規(guī)程［31］。最初的NAT檢測(cè)方法是混合樣品檢測(cè)（MP-NAT），即混合6-96個(gè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)［32］，但是MP-NAT在降低成本的同時(shí)也大大降低了檢測(cè)的敏感性，部分發(fā)達(dá)國家的血液中心開展單份樣品檢測(cè)（ID-NAT）以提高HCV檢測(cè)的敏感性［33］。

NAT方法靈敏度可檢測(cè)出載量為2.0IU/ml～9.4IU/ml水平的HCV RNA［34］，同時(shí)可縮短窗口期至4天～6天，此外，它還可以檢測(cè)出免疫靜止期攜帶者體內(nèi)的病毒。當(dāng)NAT篩查方法用于輸血前篩查后，輸血感染HCV的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步顯著下降。美國于1999年開始使用NAT技術(shù)在獻(xiàn)血者中篩查HCV，在此之后的10年間6600萬HCV抗體陰性的獻(xiàn)血者中，NAT檢測(cè)方法共篩查出244例獻(xiàn)血者HCV陽性，與1999年相比，2008年的獻(xiàn)血者中HCV流行率下降了53%［35］。德國在1990年至1998年間，每年大約有7起輸血感染HCV病例發(fā)生，但在使用NAT檢測(cè)后，幾乎沒有新增病例的報(bào)道［36］。NAT技術(shù)以其高敏感性和特異性已得到廣泛應(yīng)用，但是仍存在一些抗體陽性，NAT檢測(cè)陰性的報(bào)道，國內(nèi)有學(xué)者對(duì)47004份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)比較，ELISA檢測(cè)到的HCV抗體陽性樣本總數(shù)共245份，而NAT檢測(cè)HCV RNA陽性結(jié)果為12份，最終確定15份為HCV陽性［37］。另外，NAT技術(shù)對(duì)儀器、設(shè)備以及人員培訓(xùn)均有較高的要求，在部分欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)推廣使用受到限制。

7　結(jié)語

臨床輸血的風(fēng)險(xiǎn)最小化和利益最大化需要血液中心提供充足和安全的血液，“零容忍”是人們對(duì)輸血風(fēng)險(xiǎn)的態(tài)度。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，輸血風(fēng)險(xiǎn)不斷降低，但各檢測(cè)試劑仍有其優(yōu)缺點(diǎn)，尚不能以某一種方法代替其他方法。ELISA抗體檢測(cè)雖然價(jià)格便宜，但窗口期較長；HCV核心抗原檢測(cè)操作易行，敏感性高，費(fèi)用低廉，但易受到體內(nèi)抗體的影響?？焖贆z測(cè)簡便、易行，但其敏感性較差。NAT檢測(cè)在現(xiàn)階段提供了最安全的保障，但其昂貴的價(jià)格制約了全面推廣。因此，各檢查技術(shù)應(yīng)相互結(jié)合，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，以降低輸血感染HCV的風(fēng)險(xiǎn)，保障血液安全。

我國從1998年開始在獻(xiàn)血者中全面采用兩種試劑檢測(cè)HCV抗體，但單純抗體檢測(cè)存在一定的假陰性和假陽性。最新的《血站技術(shù)操作規(guī)程（2012版）》建議：采用2個(gè)不同生產(chǎn)廠家的ELISA試劑檢測(cè)HCV抗體或聯(lián)合檢測(cè)HCV抗原和抗體；或者采用1種ELISA試劑檢測(cè)HCV抗體或聯(lián)合檢測(cè)HCV抗原和抗體，采用1種試劑檢測(cè)HCV核酸。我國目前仍處于發(fā)展中國家，各地區(qū)應(yīng)根據(jù)經(jīng)濟(jì)發(fā)展特點(diǎn)，結(jié)合獻(xiàn)血人群HCV流行病學(xué)分布，調(diào)整HCV篩查策略，制定安全可靠、符合經(jīng)濟(jì)成本的血液篩查方案。

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（收稿：2014-05-23）

（本文編輯：張駿飛）

第一作者：張佳娟 ，女，32歲，大學(xué)?？?，護(hù)師。主要從事血液檢驗(yàn)和采集工作。E-mail：leep2002@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.031

作者單位210003南京市 紅十字血液中心（張佳娟）；解放軍第81醫(yī)院（李平）

Screening tests for hepatitis C virus infection in blood donors:does it safe or not？ Zhang Jiajuan，Li Ping.Department of Physical examination and Blood Branch，Blood Center，Red Cross，Nanjing 210003，China

【Abstract】Hepatitis C virus（HCV）is a single-stranded RNA virus that is about 9.6 kb.Its open reading frames encoding structural proteins and non-structural proteins.HCV infection is approximately 3%worldwide.It is one of the most serious infection diseases that threaten human health.Screening tests in blood donors is the most effective means to prevent the communication of HCV.The current methods for screening tests include detection of HCV antigen，anti-HCV antibody，HCV antigen-antibody complex，and HCV genes.Antigen detection is the initial screening test and it detects seroconversion after a long infectious window period.The detection of HCV core antigen might shorten the window period and has a high sensitivity，but interference by immunoglobulins in vivo influence its widespread uses.Rapid tests is simple to perform，but its sensitivity is low.Molecular testing for HCV RNA utilizing nucleic acid amplification technology（NAT）is the most sensitive assay and can shorten the window period，while the costs is very expensive.Each screening tests for HCV infection has its advantages and disadvantages.Currently，the blood centers are using at least two different reagents to detect HCV antibodies for blood screening.

【Key words】Hepatitis C virus；Post-transfusion hepatitis；nucleic acid amplification technology；Blood donors