侵襲性毛孢子菌病的實(shí)驗(yàn)室早期診斷進(jìn)展

田艷麗，廖 勇，呂雪蓮，楊蓉婭

侵襲性毛孢子菌病是由毛孢子菌屬所致的系統(tǒng)性感染，近年來報(bào)道的病例數(shù)逐年增多，多見于血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及其他免疫缺陷的患者，盡管給予抗真菌治療，病死率仍較高（50%～80%）[1]。實(shí)驗(yàn)室診斷是毛孢子菌防治的重要依據(jù)，特別是早期實(shí)驗(yàn)室診斷對于改善該病的預(yù)后至關(guān)重要?，F(xiàn)有檢測毛孢子菌的方法可分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法。培養(yǎng)法是檢測真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)時(shí)間長，對檢測人員專業(yè)技能要求較高，特異性和敏感性低，且不能區(qū)分非致病性定植與侵襲性感染。與培養(yǎng)法相比， 非培養(yǎng)方法具有檢測時(shí)間短、敏感性和特異性相對較高的特點(diǎn)。本文就侵襲性毛孢子菌病非培養(yǎng)檢測方法的研究進(jìn)展作一闡述。

1 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法是通過檢測病原真菌特異性的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物等診斷侵襲性真菌感染的方法，為診斷及評價(jià)疾病的狀態(tài)和預(yù)后提供線索和依據(jù)。

1.1 (1, 3)-β-D葡聚糖抗原[ (1,3)-β-D-glucan, BG]的檢測（G試驗(yàn)）

BG 是廣泛存在于各類真菌細(xì)胞壁上的抗原成分，除接合菌(毛霉菌和根霉菌)外，所有病原真菌的細(xì)胞壁上均含有BG。G 試驗(yàn)被廣泛地用于侵襲性真菌感染的檢測，包括念珠菌病和曲霉病[2]的早期診斷。當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理，BG 可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其他體液（如尿液、腦脊液，腹水，胸水等）中出現(xiàn)BG，且隨感染的加重，其含量增高。

Yamamoto 等[3]最早報(bào)道了阿薩希毛孢子菌感染小鼠模型中BG 血清水平與抗真菌制劑使用存在量效關(guān)系，并推斷BG 抗原檢測可以用于侵襲性毛孢子菌病診斷和治療有效性的監(jiān)測。祝賀等[4]檢測了侵襲性毛孢子菌動(dòng)物模型中血漿、支氣管肺泡灌洗液、尿液標(biāo)本的BG 水平，G 試驗(yàn)的平均敏感性分別為76.67%、80.00%、10.00%，其中血漿、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的檢測結(jié)果與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而尿液標(biāo)本的檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道G 試驗(yàn)在侵襲性毛孢子菌病的診斷敏感性和特異性的研究結(jié)果。Suzuki 等[5]分析33 例侵襲性毛孢子菌病患者的流行病學(xué)和臨床特征，發(fā)現(xiàn)一組患者的G 試驗(yàn)只有50%呈陽性，而血培養(yǎng)陽性的患者中僅有少數(shù)G 試驗(yàn)陽性。Nakase 等[6]報(bào)道28 例侵襲性毛孢子菌病的血液病患者，僅有50%患者的G 試驗(yàn)呈陽性，然而G 試驗(yàn)陰性患者的總生存期與早期感染病死率均顯著高于G 試驗(yàn)陽性患者。

有報(bào)道，G 試驗(yàn)不能用于隱球菌感染的診斷，一方面可能因?yàn)殡[球菌在免疫缺陷患者體內(nèi)生長緩慢，并形成厚莢膜。另一方面可能與新生隱球菌產(chǎn)生的BG 量比念珠菌和曲霉少相關(guān)。和新生隱球菌相似，阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁BG 含量較少，G 試驗(yàn)是否可以用于毛孢子菌感染的檢測還有待進(jìn)一步深入研究。

1.2 葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan，GXM )檢測（乳膠凝集試驗(yàn)）

GXM 在新生隱球菌莢膜中含量最高，占莢膜成分的90%以上[7]，具有抗原性。利用乳膠凝集試驗(yàn)檢測GXM 是目前臨床上診斷隱球菌感染的最重要方法之一。GXM 也存在于毛孢子菌中,是阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁的重要組成成分[8]，尚未在其他病原真菌中發(fā)現(xiàn)。

Campbell 等[9]最早報(bào)道毛孢子菌感染的病死患者出現(xiàn)乳膠凝集試驗(yàn)的陽性結(jié)果。Lyman 等[10]在白吉利毛孢子菌臨床分離株和環(huán)境分離株中均檢測到GXM 抗原，且有研究表明，阿薩希毛孢子菌臨床分離株比環(huán)境株釋放更多的GXM 抗原[11]。Fonseca 等[12]研究了阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁GXM 的功能和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞壁錨定、抗原性和抗吞噬能力上，與隱球菌莢膜GXM 具有相似性。然而，與新生隱球菌不同的是，37 ℃時(shí)，阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁和胞外分泌的GXM 表達(dá)下調(diào)。由于人類正常體溫在 37℃左右，所以阿薩希毛孢子菌與新生隱球菌相比，其在感染宿主體內(nèi)的GXM 抗原表達(dá)水平較低。有研究者認(rèn)為GXM 或GXM 結(jié)合BG 抗原檢測比單用BG 抗原檢測更適合用于侵襲性毛孢子菌病的早期診斷與治療預(yù)后的判斷，但需要臨床與實(shí)驗(yàn)室檢測的進(jìn)一步研究與證實(shí)[13]。

1.3 其他抗體

Davies 和Thornton[14]利用雜交瘤技術(shù)制備出2個(gè)鼠單抗MAbs：CA7 和TH1。通過免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡法研究表明， CA7 是一種免疫球蛋白G1（IgG1），主要結(jié)合于阿薩希毛孢子菌和星形毛孢子菌菌絲表面的一個(gè)60 kDa 的糖蛋白抗原。而TH1 是一種免疫球蛋白M（IgM），結(jié)合于分生孢子表面的特異性抗原。這兩種單抗可特異性的識別和鑒定出阿薩希毛孢子菌和星形毛孢子菌，而不與毛孢子菌屬中的其他菌種結(jié)合，同樣也不識別其他常見的臨床致病真菌，包括念珠菌屬、隱球菌屬、曲霉屬、鐮刀霉、足放線病菌屬和毛霉菌屬。

2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在播散性毛孢子菌病的應(yīng)用

2.1 PCR及相關(guān)技術(shù)

PCR 是通過擴(kuò)增毛孢子菌特異基因片斷而獲得的快速、靈敏和特異的診斷方法。毛孢子菌的核糖體RNA 基因總長度約為7 850 bp[1,15]，其中，結(jié)構(gòu)基因（SSU，5.8/5s，LSU）是高度保守基因序列，可以作為真菌屬水平的分類及通用引物的設(shè)計(jì)。LSU 中的D1/D2 可變性較大，部分可以作為真菌種水平的鑒定，而作為種水平的鑒定的特異性的基因片段是內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔ITS 區(qū)，基因間隔區(qū)IGS 區(qū)用于種內(nèi)分型及菌株鑒定[15]。由于毛孢子菌種屬的基因差異決定了對不同抗真菌藥物敏感性有所不同，正確鑒定毛孢子菌種屬對治療藥物的選擇、提高臨床療效和降低病死率至關(guān)重要。

Hosoki 等[16]檢測1 例組織細(xì)胞吞噬性脂膜炎臍帶血移植治療后患者，在使用抗真菌預(yù)防性治療的同時(shí)，應(yīng)用巢式PCR 早于血清學(xué)培養(yǎng)和臨床菌血癥癥狀出現(xiàn)前1 周檢測出患者繼發(fā)毛孢子菌感染。隨后的中心靜脈導(dǎo)管培養(yǎng)證實(shí)感染阿薩希毛孢子菌，該例患者的血清PCR 檢測反應(yīng)陽性持續(xù)到第39 天，直至該例患者進(jìn)行抗真菌治療成功后巢式PCR 檢測才轉(zhuǎn)為陰性。而在此期間BG 血清滴度一直保持正常水平。Nakajima 等[17]提取肺癌患者的肺活檢標(biāo)本的總DNA,擴(kuò)增真菌ITS 區(qū)域進(jìn)行測序，并成功鑒定出感染的病原體是阿薩希毛孢子菌。 Nagano 等[18]對77例肺囊性纖維化患者應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)與PCR 技術(shù)檢測真菌，收集痰樣本提取DNA，擴(kuò)增ITS 區(qū)域進(jìn)行測序分析。77 個(gè)樣本通過PCR 技術(shù)鑒定出2 例毛孢子菌屬感染，培養(yǎng)的方法僅發(fā)現(xiàn)1 例陽性。

與血清學(xué)檢測相比，PCR 技術(shù)具有更高的敏感性。Nagai 等[19]對11 例組織病理明確診斷的播散性毛孢子菌病患者的血清樣本進(jìn)行巢式PCR 檢測，引物針對28S rDNA 序列設(shè)計(jì)。在11 例患者樣本中，PCR 檢測7 例陽性，GXM 檢測6 例陽性。Sugita 等[20]分別通過PCR 法和乳膠凝集試驗(yàn)檢測11 份血清，這些血清來自7 例尸檢證實(shí)的侵襲性毛孢子菌病患者，針對阿薩希毛孢子菌的ITS 區(qū)設(shè)計(jì)菌種特異性引物；11份血清中，9 份巢式PCR 檢測陽性，7 份乳膠凝集試驗(yàn)陽性。Mekha 等[21]對侵襲性毛孢子菌病患者的21份血清進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR，引物基于rDNA 的IGS1 區(qū)設(shè)計(jì)，實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測樣本均為陽性，而乳膠凝集試驗(yàn)檢測陽性的只有16 份。

2.2 芯片技術(shù)

基因芯片是研究生物大分子功能的新技術(shù),具有高通量、微型化、連續(xù)化、自動(dòng)化、快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。利用該技術(shù)結(jié)合多重PCR 針對ITS1、18S、5.8S 序列的微陣列雜交檢測91 個(gè)樣品，鑒定出14 種病原真菌，其中包括阿薩希毛孢子菌[22]。Hsiue 等[23]設(shè)計(jì)針對ITS1 或ITS2 區(qū)域寡核苷酸微陣列芯片用于分析116 例患者血培養(yǎng)真菌陽性的標(biāo)本。該系統(tǒng)識別并鑒定16 個(gè)酵母菌屬的77 個(gè)菌種，并能夠檢測和鑒定出2 個(gè)樣本中的阿薩希毛孢子菌陽性，而表型的方法僅有1 個(gè)樣本陽性。

Landlinger 等[24]應(yīng)用Luminex xMAP 技術(shù)檢測患者的外周血、血液培養(yǎng)樣本、肺部浸潤活檢組織、支氣管肺泡灌洗液和支氣管氣管分泌物，針對真菌基因組中高度可變ITS2 區(qū)域設(shè)計(jì)探針，檢測并鑒定出3 種臨床致病的毛孢子菌：阿薩希毛孢子菌、因肯毛孢子菌和皮樣毛孢子菌。同時(shí)，從石蠟包埋的組織中檢測鑒定到皮樣毛孢子菌感染。

用探針設(shè)計(jì)除了可以識別ITS 區(qū)和間隔區(qū)1（IGS1），還 可 以 包 括28S rDNA 序 列 的D1/D2 區(qū)域。Diaz 和Fell[25]使用Luminex100 流式熒光雜交試驗(yàn)，鑒定39 株不同的毛孢子菌，且證實(shí)利用ITS 和D1/D2 區(qū)域區(qū)分種屬是靈敏的，IGS 的區(qū)域可用于區(qū)別種屬關(guān)系密切的菌種，如阿薩希毛孢子菌、日本毛孢子菌和星形毛孢子菌。

2.3 PCR衍生技術(shù)的應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）法是利用PCR 擴(kuò)增相應(yīng)目的片斷，而后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切反應(yīng)，電泳后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。Fadda 等[26]通過研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增18S-ITS1-5.8S (r)DNA，并應(yīng)用HaeIII 內(nèi)切酶消化進(jìn)行PCR-RFLP 法檢測，可鑒定出API 生化系統(tǒng)不能檢測出的毛孢子菌，結(jié)合D1/D2 區(qū)域的測序，鑒定出Trichosporon gracile。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplifi cation，LAMP），是針對靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 對特異引物，在鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60 ～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，15 ～60 min 即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有操作簡單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測等特點(diǎn)。Kasahara 等[27]針對毛孢子菌26S 和5S rRNA 基因間隔中的IGS1 區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP 引物，可以在1 h 內(nèi)檢測并鑒別出1 ml 培養(yǎng)液中1 ～103個(gè)菌量的毛孢子菌或念珠菌，并成功鑒定出阿薩希毛孢子菌和粘性毛孢子菌。

3 展望

近年來，隨著侵襲性毛孢子菌病報(bào)道的病例數(shù)逐年增多，越來越多的研究開始關(guān)注于該疾病的診斷與治療。侵襲性毛孢子菌病病死率高，因此該病的早期診斷具有重要的臨床意義。非培養(yǎng)檢測方法包括：血清學(xué)檢測、PCR 技術(shù)等均具有各自的優(yōu)勢。血清學(xué)檢測具有簡便快速的特點(diǎn)，但檢測方法的敏感性和特異性尚需進(jìn)一步研究與證實(shí)。相比之下，PCR 及其相關(guān)技術(shù)更可快速、敏感、特異的檢測出病原菌并鑒定菌種，是快速早期診斷發(fā)展的主流。但 PCR 過程中也存在一些問題，如檢測過程缺乏規(guī)范化，極少量的污染便可出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測的敏感性和特異性報(bào)道不一，PCR 結(jié)果必須結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)和其他的檢查結(jié)果，才能作出正確的判斷。侵襲性毛孢子菌病中重要致病菌阿薩希毛孢子菌的全基因組序列已經(jīng)破譯[28]，發(fā)現(xiàn)更特異的檢測基因靶位，對于該疾病的更多深入研究將會進(jìn)一步推動(dòng)早期診斷技術(shù)的發(fā)展。

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