腦出血后缺氧誘導因子-1α及熱休克蛋白70作用機制的研究

范賢敏，羅永杰

(1.瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

腦出血后缺氧誘導因子-1α及熱休克蛋白70作用機制的研究

范賢敏1，羅永杰2△

(1.瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是缺氧誘導基因轉錄的關鍵環(huán)節(jié)，并且是缺氧誘導基因轉錄過程中缺氧信息傳遞的共同通路；而熱休克蛋白70(Hsp70)具有調控細胞凋亡和參與應激等多種生物學功能，在缺氧性腦血管病的病理生理過程中起著重要的作用。目前國內外研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、Hsp70與腦出血后腦組織的保護及損傷有密切聯(lián)系。本文就HIF-1α、Hsp70的生物學特點，在腦出血后腦組織中的表達及作用機制等方面作一綜述。

缺氧誘導因子-1α；熱休克蛋白70；腦出血

最近發(fā)布的全球疾病負擔研究(GBD2010)顯示腦卒中是全球第二大死因，是造成過早死亡和殘疾的第三大主要原因，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦血管疾病總的疾病負擔分類中出血性卒中比例高達35.7%[1，2]。腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)發(fā)病后的作用機制及治療一直都是醫(yī)學界研究的熱點，本文就缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、熱休克蛋白70(Hsp70)在ICH后的作用機制研究做一綜述。

1 HIF-1α及Hsp70的分子結構及功能

1.1 HIF-1α的分子結構及功能 HIF-1屬于DNA結合蛋白，是一種由細胞內低氧環(huán)境所誘導表達的轉錄激活因子，主要由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基以異二聚體復合物的形式存在。α亞基位于胞漿中，其分子大小為120 kD，受細胞內氧濃度調節(jié)，其濃度水平隨著低氧水平的增加而呈指數(shù)上升。位于細胞核中的β亞基的分子大小為91～94 kD，不受氧濃度的調節(jié)，因此其表達相對穩(wěn)定。其中α亞基包含有兩個重要的結構域：①氧依賴降解結構域，主要調節(jié) HIF-1 的穩(wěn)定性；②C 末端轉錄激活結構域和內在激活結構域，則主要調節(jié) HIF-1的轉錄活性。然而β亞基的作用尚不清楚，目前多數(shù)認為可能與促進 HIF-1α的磷酸化，維持其穩(wěn)定性以及二聚體化后引起的活性構象改變有關[3]。故HIF-1α是HIF-1 的調節(jié)亞基和活性亞基，在缺氧誘導下HIF-1 的作用主要體現(xiàn)在 HIF-1α亞基的調節(jié)上，并可根據(jù)氧濃度水平而動態(tài)表達，可與許多靶基因的缺氧反應元件結合，在缺氧誘導的基因表達中起關鍵作用。

1.2 Hsp70的分子結構及功能 Hsp是一個龐大的糖蛋白超基因家族，具有分子伴侶、調控細胞凋亡周期和參與應激等廣泛的生物學功能，對缺血性損傷有保護作用[4]。根據(jù)相對分子質量大小、抗原性的差異和產(chǎn)物的同源性，通常將哺乳動物HsPs家族分為6類：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及相對小分子質量 HsPs(15～30 kU)[5]。其中Hsp70是一種在缺氧缺血等腦損傷后產(chǎn)生的應激蛋白，在應激條件下合成最為迅速，具有高度保守性，是各種腦損傷的敏感標志物[6]。Hsp70作為應激保護蛋白，除了發(fā)揮其分子伴侶作用抑制蛋白激酶的激活，還可抑制神經(jīng)細胞的凋亡，從而起到腦保護作用。Hsp70可能通過多種方式對節(jié)細胞凋亡：一是Hsp70能干擾應激所啟動的凋亡程序；另外升高的Hsp70水平可能通過對變性細胞的凋亡抑制蛋白Bcl-2加以修復或防止其被降解，下調有關細胞凋亡的基因、蛋白和蛋白酶活性，抑制細胞凋亡，從而增強受損細胞抗凋亡能力[7]，也可通過抑制JNK /BIM 途徑來抑制 Bax 的激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用[8]。

2 HIF-1α、Hsp70的動態(tài)表達及機制

2.1 HIF-1α表達的動態(tài)變化及機制 有動物實驗研究表明，HIF-1α在正常腦組織中基本不表達，小鼠腦出血成功造模4 h后，出血灶周圍腦組織HIF-1α蛋白表達就開始出現(xiàn)，并逐漸增多，1～2 d 達到高峰，7 d后又下降至第1天水平以下[9]。國內臨床研究結果證實此觀點，患者在腦出血后 4 h 血腫周圍腦組織可見散在 HIF-1α表達，1～2 d 達到高峰，2～3 d仍繼續(xù)保持高表達狀態(tài)并維持到第7 d，從第7 d開始逐漸衰減，但在21 d時血腫周邊腦組織中尚可見到HIF-1α蛋白的表達[10]。由于HIF-1α是一種參與調節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的對低氧敏感的核轉錄因子，并且在腦出血后不同時期呈動態(tài)表達，其表達機制目前認為主要有以下幾種：①細胞內缺氧是 HIF-1 α 表達最主要的誘導調節(jié)因子，其表達增強的機制可能與細胞線粒體在低氧狀態(tài)下產(chǎn)生大量的活性氧基以及與腦組織缺血/再灌注后產(chǎn)生的羥基有關[11]，它們能 HIF-1α免于被迅速降解。②國內研究卻發(fā)現(xiàn)缺氧并不是誘導HIF-1α表達增加的唯一機制，有研究發(fā)現(xiàn)腦出血早期在血腫周邊腦組織中HIF-1α蛋白表達的陽性率較低，隨著病程的延長HIF-1α表達逐漸增加，分別將凝血酶及紅細胞注入腦組織后，HIF-1α表達均能升高，說明血腫內的凝血酶、血紅蛋白等血液成分也可促進 HIF-1α的表達上調[12]。③隨著出血時間的延長，血腫周圍腦組織水腫及血腫中破碎的紅細胞以及逐漸釋放出來的IL-1β、TNF-α等炎性介質亦可通過其他信號途徑上調HIF-1α的表達[13]。

2.2 Hsp70表達的動態(tài)變化及機制 正常情況下Hsp70在細胞內有穩(wěn)定的表達，但降解迅速，所以正常腦組織 Hsp70 蛋白質的含量極少[14]。但在腦出血等急性應激狀態(tài)下，當其他蛋白質合成受到抑制時，Hsp70 的表達反而增加，它能夠保護大腦防止各種應激刺激，使細胞對損害的耐受能力增強[15]。在我們前期的實驗中觀察到在腦出血后6 h時Hsp70開始在血腫周圍組織中表達，隨著出血時間的延長，其表達逐漸增加，在3 d時達高峰并在7 d時表達明顯減少。在缺氧可顯著上調HIF-1α表達的理論基礎上，有學者通過使用HepG2細胞進行研究探討，實驗采用HIF-1α抑制劑YC-1抑制HIF-1α的表達，結果顯示隨著YC-1濃度的增加，HIF-1α表達明顯受到抑制，Hsp70-2表達隨之減弱。實驗還從另一角度設計合成針對HIF-1α表達的特異小干擾RNA(siRNA)，用以轉染HepG2細胞，結果同樣顯示在HIF-1α siRNA顯著降低HIF-1α表達的同時Hsp70-2表達減少[16]。根據(jù)實驗結果，我們可以得出在HepG2細胞HIF-1α是促進Hsp70表達的誘導劑，但是在缺血缺氧性腦病中這種誘導關系仍待驗證。

3 HIF-1α、Hsp70在腦出血后的作用機制

腦出血后腦組織損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩個方面，原發(fā)性腦損傷主要是指血腫直接對腦組織造成機械性的壓迫損傷。由于顱內血腫引起局部循環(huán)障礙，造成的血腫周邊腦組織缺血缺氧、炎性反應及補體介導的免疫損傷、血紅蛋白及其降解產(chǎn)物的毒性反應及機體的應激反應，上述損傷因素之間相互作用，共同參與導致繼發(fā)腦損傷[17，18]。

3.1 HIF-1α的作用機制 腦出血后血腫周圍組織由于缺血缺氧、腦水腫的形成和血液成分及炎性物質的釋放等因素誘導腦細胞HIF-1α的表達。HIF-1α能介導相關靶基因的表達調控，從而在出血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。HIF-1α及相關靶基因可能通過多種機制對腦組織發(fā)揮保護作用：①促進血管生成和神經(jīng)再生：血腫周圍腦組織在低氧條件下HIF-1α表達的增多，進而誘導血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體表達增加，當血管內皮細胞和神經(jīng)干細胞中的VEGF被激活后，可促進血管內皮細胞增殖以及神經(jīng)干細胞分化、移行，從而促進血管生成和神經(jīng)細胞再生，恢復出血灶周邊缺血缺氧組織的血供和氧供[19]。②提高攜氧能力：缺氧時HIF-1α表達可誘導促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)以及促紅細胞生成素受體(Erythropoietin receptor，EPOR)等調節(jié)氧運輸基因的表達增加，從而促進紅細胞生成，提高其攜氧能力，增加缺血區(qū)域的氧運輸，降低神經(jīng)細胞的缺氧敏感性，增強神經(jīng)細胞的存活能力，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[20]。③抑制細胞凋亡：在HIF-1α的調節(jié)下VEGF轉錄表達并與受體結合，進而激活 PI-3K/AKT信號途徑，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性，并活化 NF-κB，同時抑制 p53 的活化，促進多種生長因子的表達[21]。由此可見，HIF-1α主要是通過誘導靶基因的表達以及調控細胞凋亡途徑來實現(xiàn)腦的保護作用。

3.2 Hsp70的作用機制 Hsp70作為一種內源性保護因子，在腦卒中進程中發(fā)揮保護作用，關于Hsp70保護作用機制目前已有較多的研究，總結起來主要有以下4種：①抗氧化應激作用：Hsp70可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶的活性，可能在轉錄水平或通過轉錄后的修飾調節(jié)SOD的表達，加快氧自由基的清除，增強細胞的抗氧化應激能力；②抗炎及免疫增強作用：近來許多研究表明，炎癥在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用；③分子伴侶作用：當細胞在應激源刺激下產(chǎn)生大量未折疊、錯折疊的蛋白質時，Hsp70的分子伴侶作用可幫助需要折疊的蛋白質正確折疊，維持細胞的正常生理功能，實現(xiàn)對腦細胞的保護；④抑制細胞凋亡作用：Hsp70 能干擾應激所啟動的凋亡程序；另外升高的Hsp70水平可能通過下調有關細胞凋亡的基因、蛋白和蛋白酶活性，抑制細胞凋亡，從而增強受損細胞抗凋亡能力，故Hsp70也被視為一種抗凋亡蛋白。上述Hsp70在腦出血后缺血缺氧的應激狀態(tài)下可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此給予適當預刺激從而誘導Hsp70的表達，增強腦細胞對缺血缺氧等損害的耐受力，這可能成為減輕腦血管疾病后繼發(fā)性腦損傷的新方法。

4 展望

由于腦組織對缺血缺氧十分敏感，而機體的缺氧應答反應涉及缺氧反應基因表達、調控、轉錄因子激活、細胞因子及眾多信號通路的參與，其中HIF-1α在缺氧應答中處于關鍵核心位置。HIF-1α對于缺血缺氧性腦損傷的治療研究還僅限于動物實驗。目前關于HIF-1α在腦出血中表達上調的機制尚不十分明確，并且HIF-1α下游基因的轉錄及其參與的低氧信號轉錄在發(fā)揮保護作用的同時，其所具有的損傷作用及相關風險尚未完全明確，仍需我們做更進一步的探索研究。

[1] Chin JH，Vora N.The global burden of neurologic diseases[J].Neurology，2014，83(4)：349-351.

[2] 王曉平，羅永杰，馬思文，等.Bcl-2、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶在SD大鼠腦梗死急性期的動態(tài)表達研究[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2013，10(5)：53-56.

[3] Schofield C，Ratcliffe PJ.Oxygen sensing by HIF hydroxylases[J].Nat Rev Moi Cell Biol，2004，5(5)：353-354.

[4] Manaenko A，F(xiàn)athali N，Chen H，et al.Heat shock protein70 up regulation by geldanamycin reduces brain injury in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J].Neurochemint，2010，57(7)：844-850.

[5] Khalil AA，Kabapy NF，Deraz SF，et al.Heat shock proteins in oncology：diagnostic biomarkers or therapeutic targets[J].Biochim Biophys Acta，2011，1816(2)：89-104.

[6] Manaenko A，F(xiàn)athali N，Chen H，et al.Heat shock protein70 up regulation by geldanamycin reduces brain injury in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J].Neurochemint，2010，57(7)：844-850.

[7] Li H，Liu L，Xing D，et al.Inhibition of the JNK/Bimpathway by Hsp70 prevents Bax activation in UV-induced apoptosis[J].FEBS Lett，2010，584(22)：4672-4678.

[8] Nagashima M，F(xiàn)ujikawa C，Mawatari K，et al.HSP70，the earliest-induced gene in the zebrafish retina during optic nerve regeneration：Its role in cell survival[J].Neurochem Int，2011，58(8)：888-895.

[9] Zhang Y，Shao Z，Zhai Z，et al.The HIF-1 hypoxia-inducible factor modulates life span in C.elegant[J].PLoS One，2009，4(7)：e6348.

[10]王愛岳，李強，周治平.HIF-1α、VEGF在腦出血灶周的表達意義[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2009，1(12)：1-3.

[11]Chandel NS，McClintock DS，F(xiàn)eliciano CE，et al.Reactive oxygenspecies generated at mitochondrial complex Ⅲ stabilize hypoxia-in-duced factor 1α during hypoxia[J].J Biol Chem，2000，275(33)：25130-25138.

[12]婁季宇，王愛岳，李強.低氧誘導因子-lα在大鼠腦出血灶周的表達[J].實用神經(jīng)疾病雜志，2005，8(4)：1-2.

[13]Sharp FR，Bernaudin M.HIF-1 and oxygen sensing in the brain[J].Nat Rev Neurosci，2004，5(6)：437-448.

[14]Fang HY，Ko WJ，Lin CY.Inducible heat shock protein70，interleukin-18，and tumor necrosis factor alpha correlate with outcomes in spontaneous intracerebral hemorrhage[J].Clin Neurosci，2007，14(5)：435-441.

[15]劉玉婷，王國英，牛小媛.腦缺血再灌注大鼠外周血熱休克蛋白70的表達與神經(jīng)功能缺損的相關性研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2008，2(5)：90-91.

[16]夏麗敏，田德安，張瓊，等.缺氧誘導熱休克蛋白70-2表達的分子機制[J].中華肝臟病雜志，2009，17(3)：207-212.

[17]Keep RF，Hua Y，Xi G.Intracerebral haemorrhage：mechanisms of injury and therapeutic targets[J].Lancet Neurol，2012，11(8)：720-731.

[18]Joice SL，Mydeena F，Couraud PO，et al.Modulation of blood-brain barrier permeability by neutrophils：in vitro and in vivo studies[J].Brain Res，2009，1298：13-23.

[19]Zacchigna S，Lambrechts D，Carmeliet P.Neurovascular signalling defects in neurodegeneration[J].Nat Rev Neurosci，2008，9(3)：169-181.

[20]Freret T，Valable S，Chazalviel L，et al.Delayed administration of deferoxamine reduces brain damage and promotes functional recovery after transient focal cerebral ischemia in the rat[J].Eur J Neurosci，2006，23(7)：1757-1765.

[21]Maddika S，Ande SR，Panigrahi S，et al.Cell survival，cell death and cell cycle pathways are interconnected：implications for cancer therapy[J].Drug Resist Update，2007，10(1-2)：13-29.

The research progress on the mechanism of HIF-1α and Hsp70 after intracerebral hemorrhage

FAN Xian-min，LUO Yong-jie

R743.34

B

1672-6170(2015)03-0187-03

2015-01-07；

2015-03-05)

△通訊作者，碩士生導師