泰州地區(qū)鴨源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性試驗(yàn)

劉玉華　陳光明　方向紅　戴麗紅

摘要：以泰州地區(qū)15羽臨床疑似大腸桿菌病病死鴨為病料進(jìn)行病原分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗(yàn)，分離鑒定出13株大腸桿菌。對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，13株大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥率最低，對(duì)鏈霉素的耐藥率最高。對(duì)氟苯尼考、阿米沙星、大觀霉素的耐藥率相對(duì)較低（分別為154%、231%、308%，而對(duì)大多數(shù)抗菌藥物則表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象非常普遍，大多數(shù)大腸桿菌都是5耐、6耐、7耐甚至8耐。

關(guān)鍵詞：鴨；大腸桿菌；分離鑒定；耐藥性試驗(yàn)

人和動(dòng)物腸道內(nèi)均有大腸桿菌存在，正常條件下大多數(shù)大腸桿菌是不致病的共棲菌，在特定條件下可致病。少數(shù)大腸桿菌與人、[JP2]動(dòng)物的大腸桿菌病密切相關(guān)[1]。致病性大腸桿菌的許多血清型可引起家畜、家禽發(fā)病。近年來(lái)，隨著江蘇省泰州地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)的快速發(fā)展，鴨大腸桿菌病也愈來(lái)愈常見，臨床上主要應(yīng)用抗菌藥物來(lái)預(yù)防、治療鴨大腸桿菌病，但大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，加上養(yǎng)殖戶盲目選用抗菌藥物，造成大腸桿菌耐藥性逐年嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究選擇泰州地區(qū)臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨進(jìn)行大腸桿菌病的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)，旨在為選擇有效的抗菌藥物提供參考。

1材料與方法

11材料

泰州地區(qū)臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨15羽。培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素、檸檬酸鹽、蛋白胨水、硫化氫等生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司，甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)等試驗(yàn)所用試劑均為自制。藥敏紙片：四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、鏈霉素等9種藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。頭孢噻呋、大觀霉素、阿米卡星（廣州市輝康生物科技有限公司。大腸桿菌（ATCC25922購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

12方法

對(duì)15羽臨床疑似大腸桿菌病死鴨剖檢，從肝臟無(wú)菌取病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，用麥康凱瓊脂進(jìn)行純化，觀察平板上的菌落特征，并挑取紅色菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。純化后可疑菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化，37 ℃培養(yǎng)18 h，用于生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)。

121生化試驗(yàn)

取瓊脂平板上的菌落按常規(guī)方法進(jìn)行吲哚、甲基紅、V-P、檸檬酸鹽、葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素酶、硫化氫等生化試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

122藥敏試驗(yàn)

以大腸桿菌（ATCC25922為標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用紙片擴(kuò)散法（-B法測(cè)試大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素、阿米沙星、鏈霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等12種抗菌藥物的敏感程度。用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的大腸桿菌單菌落 4～5個(gè)，置于滅菌生理鹽水管中，校正菌懸液的濃度至05麥?zhǔn)媳葷釂挝唬ㄏ喈?dāng)于15×108 CFU/mL。用滅菌棉拭子蘸取少量懸液，在MH瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次使平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1圈。蓋上平板，室溫靜置 3～5 min，鑷子灼燒滅菌后夾取藥敏紙片貼于MH瓊脂表面。每個(gè)平板貼6片藥敏紙片，各藥敏紙片間距離不少于 24 mm，置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。觀察藥敏紙片周圍有無(wú)抑菌圈形成，測(cè)量抑菌圈直徑（表1。

人和動(dòng)物腸道內(nèi)均有大腸桿菌存在，正常條件下大多數(shù)大腸桿菌是不致病的共棲菌，在特定條件下可致病。少數(shù)大腸桿菌與人、[JP2]動(dòng)物的大腸桿菌病密切相關(guān)[1]。致病性大腸桿菌的許多血清型可引起家畜、家禽發(fā)病。近年來(lái)，隨著江蘇省泰州地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)的快速發(fā)展，鴨大腸桿菌病也愈來(lái)愈常見，臨床上主要應(yīng)用抗菌藥物來(lái)預(yù)防、治療鴨大腸桿菌病，但大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，加上養(yǎng)殖戶盲目選用抗菌藥物，造成大腸桿菌耐藥性逐年嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究選擇泰州地區(qū)臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨進(jìn)行大腸桿菌病的分離鑒定及耐藥性試驗(yàn)，旨在為選擇有效的抗菌藥物提供參考。

1材料與方法

11材料

泰州地區(qū)臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨15羽。培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素、檸檬酸鹽、蛋白胨水、硫化氫等生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司，甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)等試驗(yàn)所用試劑均為自制。藥敏紙片：四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、鏈霉素等9種藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。頭孢噻呋、大觀霉素、阿米卡星（廣州市輝康生物科技有限公司。大腸桿菌（ATCC25922購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

12方法

對(duì)15羽臨床疑似大腸桿菌病死鴨剖檢，從肝臟無(wú)菌取病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，用麥康凱瓊脂進(jìn)行純化，觀察平板上的菌落特征，并挑取紅色菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。純化后可疑菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化，37 ℃培養(yǎng)18 h，用于生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)。

121生化試驗(yàn)

取瓊脂平板上的菌落按常規(guī)方法進(jìn)行吲哚、甲基紅、V-P、檸檬酸鹽、葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素酶、硫化氫等生化試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

122藥敏試驗(yàn)

以大腸桿菌（ATCC25922為標(biāo)準(zhǔn)菌株，采用紙片擴(kuò)散法（-B法測(cè)試大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素、阿米沙星、鏈霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等12種抗菌藥物的敏感程度。用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的大腸桿菌單菌落 4～5個(gè)，置于滅菌生理鹽水管中，校正菌懸液的濃度至05麥?zhǔn)媳葷釂挝唬ㄏ喈?dāng)于15×108 CFU/mL。用滅菌棉拭子蘸取少量懸液，在MH瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次使平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1圈。蓋上平板，室溫靜置 3～5 min，鑷子灼燒滅菌后夾取藥敏紙片貼于MH瓊脂表面。每個(gè)平板貼6片藥敏紙片，各藥敏紙片間距離不少于 24 mm，置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。觀察藥敏紙片周圍有無(wú)抑菌圈形成，測(cè)量抑菌圈直徑（表1。endprint

23藥敏試驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌（ATCC25922的抑菌圈直徑在預(yù)期范圍內(nèi)，說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程正確，可以進(jìn)行結(jié)果判定。

23113株大腸桿菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥率

由表3可知，13株大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥率最低，為0，對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，為923%。對(duì)氟苯尼考、阿米卡星、大觀霉素的耐藥率相對(duì)較低，對(duì)大多數(shù)抗菌藥物表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)阿莫西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺異[XC1TIF]唑耐藥率分別達(dá)462%、538%、615%、692%、692%、769%、846%。

本研究對(duì)泰州地區(qū)15羽臨床疑似大腸桿菌病病死鴨進(jìn)行病原分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗(yàn)，分離鑒定出13株大腸桿菌。對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，13株大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋的耐藥率最低，為0，對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，為923%。對(duì)氟苯尼考、阿米卡星、大觀霉素的耐藥率相對(duì)較低，對(duì)大多數(shù)抗菌藥物則表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)阿莫西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺異[XC1TIF]唑耐藥率分別達(dá)到462%、538%、615%、692%、692%、769%、846%。13株大腸桿菌的多重耐藥結(jié)果表明，大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象非常普遍，大多數(shù)大腸桿菌都是5耐、6耐、7耐甚至8耐。由此可知，在泰州地區(qū)，治療鴨大腸桿菌病應(yīng)盡量選用大腸桿菌耐藥率低的藥物如頭孢噻呋、氟苯尼考、阿米卡星等，盡量避免選用耐藥率高的藥物，如鏈霉素[CM（25]、磺胺異[XC1TIF]唑、氨芐西林等。由于大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，[CM]

[FL]

[H4D]

用藥前最好通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物以保證用藥效果，同時(shí)也可減少耐藥性的產(chǎn)生。李新宇報(bào)道了泰州地區(qū)大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢噻肟、阿米卡星、磺胺甲基異[XC1TIF]唑、氟苯尼考、安普霉素等藥物敏感。 陳志華等認(rèn)為，14 株鴨大腸桿菌中，786 %的菌株對(duì)10 種抗菌藥物表現(xiàn)為多重耐藥性。張俊豐等認(rèn)為，34株雞腸道大腸桿菌均為多重耐藥菌株，最少可對(duì)5種藥物耐藥，最多可對(duì)8種藥物耐藥[5]。本研究中分離的13株大腸桿菌也產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象，表明大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍。張俊豐等認(rèn)為，細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)固然重要，但對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制及耐藥性擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)行研究也同樣重要[5]。徐樹強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，即便是同一血清型也存在藥敏性差異，這說(shuō)明耐藥性與血清型無(wú)關(guān)，耐藥性的產(chǎn)生主要是由于臨床上長(zhǎng)期盲目用藥所導(dǎo)致的[6]。陳文靜等認(rèn)為，導(dǎo)致鴨臨床發(fā)病的大腸桿菌耐藥性與血清型、毒力相關(guān)基因之間并無(wú)相關(guān)性[7]?？股啬退幮允强股貞?yīng)用的結(jié)果，禽類養(yǎng)殖中應(yīng)合理使用抗生素。

[HS23][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

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