荔枝草中高車前苷的提取與分析

孔慶新　李思陽　劉凱　欽山清　顧啟明　周紅升

摘要：對荔枝草中高車前苷的提取工藝進行了研究，并對提取物進行了紅外光譜和HPLC純度分析，還對其清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼的活性進行了檢測。結(jié)果表明：在以60%乙醇為提取劑、浸提溫度60 ℃、浸提時間2 h、提取2次、料液比1 g ∶[G-3]12 mL的提取工藝條件下，荔枝草中高車前苷提取量為141 g/kg。紅外光譜分析顯示荔枝草提取物是高車前苷，純度為982%。荔枝草提取物高車前苷對DPPH的EC50=307 mg/L，對DPPH的清除率可達到90%以上，具有較強的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：荔枝草；高車前苷；提?。徽辉囼?；抗氧化

中圖分類號： R2842文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0304-02[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-17

基金項目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（編號：201313104016Y。

作者簡介：孔慶新（1978—，男，山東乳山人，碩士，副教授，從事食品生物技術(shù)研究。Email：kongxuguang@126com。

荔枝草為唇形科鼠尾草屬植物荔枝草（Salvia plebeia的全草，別稱雪見草、青蛙草等；除甘肅、新疆、西藏、青海外，全國各地均有分布[1]。據(jù)《綱目拾遺》記載，“荔枝草治咽喉十八癥，消癰腫、楊梅、痔瘡” [1-2]。現(xiàn)代研究顯示，荔枝草含高車前苷等成分，可生產(chǎn)荔枝草茶等保健食品，荔枝草的黃酮類提取物也可作為食品的抗氧化劑[1-3]。高車前苷是荔枝草中富含的一種黃酮類化合物，藥理研究表明，高車前苷具有止咳平喘、抑菌、祛痰及保肝、抗組胺等作用。目前，對荔枝草中高車前苷提取與分析的研究鮮有報道。本試驗通過研究荔枝草高車前苷的提取、分離、純化工藝研究，提取物的紅外光譜分析、HPLC純度分析和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼活性檢測，旨在為荔枝草的進一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

11材料

（1試驗材料。

荔枝草中藥飲片：購于江蘇省淮安市某藥房，經(jīng)鑒定為荔枝草的干燥全草。

（2主要儀器 。

JFSO-100型植物粉碎機、島津紫外-可見分光光度計、Agilent 1100 高效液相色譜儀、FGS-40型傅立葉紅外光譜儀、RY-NSG-20L固液浸提微型提取濃縮機、RY-JN降膜真空濃縮機組、RY-JJG-30L結(jié)晶釜、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、TGL-16G 型高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、MP-120-1電子天平等。

（3主要試劑。

98%高車前苷對照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司，DPPH（Sigma-Aldrich公司，BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，上海譜振生物科技有限公司，維生素C、維生素E（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，乙醇、冰醋酸、醋酸乙酯、甲醇、石油醚、溴化鉀等均為分析純。

12方法

121分析方法

（1高車前苷含量測定（HPLC法。

色譜條件為：Hedera ODS-2 色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm，柱溫30 ℃，甲醇-05%冰醋酸水溶液（1 ∶[G-3]1為流動相，流速1 mL/min，檢測波長335 nm。以高車前苷對照品進樣量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程y=1 0231x-4405 6（r=0 999 9，結(jié)果表明高車前苷在0 3～1 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。樣品測定：分別取同體積對照品和樣品，按照上述方法測定，用標準曲線法計算含量。

（2DPPH標準曲線的繪制及DPPH自由基清除率的計算。[JP2]

稱取02535 g DPPH，用95%乙醇制成濃度為2535 mg/L的DPPH貯備液。取100 mL貯備液至500 mL容量瓶中，用95%乙醇定容后搖勻，得到 DPPH 標準溶液（濃度為5070 mg/L。分別取DPPH標準溶液1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容后搖勻，在517 nm處測定吸光度（D。以DPPH質(zhì)量濃度（C對吸光度（D進行線性回歸，得回歸方程D=0026C+0002（r=0999 6，按照下式計算DPPH清除率。

[J]Y=（1-Ct/C0×100%。

[JP2]式中：Y表示DPPH清除率；C0表示反應(yīng)體系中DPPH起始濃度（mg/L；Ct表示反應(yīng)體系中t時刻的DPPH濃度（mg/L。

122試驗方法

荔枝草中高車前苷的提取工藝：荔枝草飲片→粉碎→溶劑提取→過濾→減壓濃縮→萃取→脫水→抽濾→硅膠柱分離→純化（重結(jié)晶→抽濾→干燥[5-7]。

1221提取溶劑選擇試驗

根據(jù)荔枝草中高車前苷的提取工藝路線，取荔枝草飲片5 kg，分別以乙醇、醋酸乙酯、甲醇、石油醚和水為提取溶劑（25 L/份，提取劑為40%、50%、60%、70%、80%等5個濃度梯度，60 ℃提取2 h，按照“121”節(jié)方法測定高車前苷含量[4-5]。

1222高車前苷提取正交試驗

分別以提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比4個因素作單因素試驗，確定正交試驗的因素水平（確定的試驗因素水平見表1；通過極差分析確定高車前苷最佳提取工藝[4-5]。

1223荔枝草提取物的分析

（1紅外光譜分析。采用

溴化鉀壓片法（溴化鉀 ∶[G-3]樣品=10 ∶[G-3]1 測定高車前苷對照品

[F（W6][HT6H][J]表1荔枝草中高車前苷提取工藝正交試驗水平[HTSS][STB]endprint

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W6。4W]因素水平A：溫度（℃B：時間（hC：次數(shù)（次D：料液比（g/mL

[BHDG12]1502021 ∶[G-3]10

[BHDW]2602531 ∶[G-3]12

3703041 ∶[G-3]14[HJ][BG）F][F）]

和荔枝草提取物的紅外光譜[5]。

（2HPLC純度分析。按照“121”節(jié)的色譜條件，用面積歸一法對提取物進行純度測定[5]。

（3DPPH活性檢測。以95%乙醇為溶劑，將維生素C、荔枝草提取物、BHT和維生素E分別配置成40 mg/L抗氧化劑溶液。在容量瓶中加入15 mL的DPPH貯備液，分別加入05、10、15、20、25、30、35、40、45 mL抗氧化劑溶液，加入95%乙醇至總體積為100 mL，搖勻靜置40 min后，測定吸光度，按照“121”節(jié)方法計算清除率[4-5，8]。

2結(jié)果與分析

21提取溶劑對高車前苷提取率的影響

由圖1可知，隨著提取溶劑濃度的升高，乙醇、醋酸乙酯、甲醇、石油醚4種溶劑的提取量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在5種提取溶劑中，乙醇的提取效果最好，水的提取效果最差。利用60%的乙醇，在60 ℃條件下提取2 h，高車前苷提取率可達0123 g/kg，原因可能是乙醇比其他溶劑極性大，對荔枝草飲片的組織、細胞的穿透力更強。

22提取工藝對高車前苷提取效果的影響

由表2極差分析可知，各因素對荔枝草中[JP2]的最終結(jié)果，所以以上推斷只能從整體上反映荔枝草可能的官能團組成，仍需采用其他分析手段進一步進行參照和對比。

232HPLC純度分析結(jié)果

荔枝草中高車前苷保留時間為272 min，高車前苷所占的峰面積比例為98 2%，說明按照“122”節(jié)工藝路線荔枝草中高車前苷純度在98%以上。

233DPPH活性檢測結(jié)果由圖3可知，在2～12 mg/L范圍內(nèi)，4種抗氧劑的DPPH清除率與其濃度都呈線性關(guān)系；其中維生素C：Y=1176C-1048，r=0999；高車前苷：Y=1125C+1546，r=0995；BHT：Y=2171C-0933，r=0997； 維生素E：Y=408x+1786，r=0996。 維生素C、 高車前苷、BHT和維生素E對DPPH均有一定的清除作用，4種抗氧劑在2～20 mg/L濃度范圍內(nèi)的清除率（Y隨著抗氧劑濃度的增大而增大。根據(jù)4種抗氧劑的線性回歸方程進行計算，維生素C、高車前苷、BHT和維生素E的EC50分別為434、307、2346、1182 mg/L；說明四種抗氧劑清除自由基能力大小順序為：高車前苷>維生素C>維生素E>BHT。荔枝[CM（25]草高車前苷具有較強的抗氧化活性，對DPPH的清除率可[CM）]

[FL]

[H4D]

達到90%以上。

3結(jié)論

在5種提取溶劑中，乙醇的提取效果最好，60%乙醇在60 ℃條件下提取2 h，高車前苷提取率可達0123 g/kg。

最佳組合為A2B1C1D2，即提取溫度為60 ℃、提取時間20 h、提取2次、料液比為1 g ∶[G-3]12 mL，在此組合下高車前苷提取量為141 g/kg。

荔枝草有—OH、—CH2—、—CH3—、烷基醛、苯環(huán)、Ar—O—C、芳烴等官能團，表明荔枝草提取物為黃酮類物質(zhì)高車前苷，高車前苷純度為982%。

荔枝草提取物高車前苷對DPPH的EC50=307 mg/L，具有較強的抗氧化活性，對DPPH的清除率可達到90%以上。

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高車前苷提取量的影響主次順序為：提取溫度>提取時間>提取次數(shù)>料液比。根據(jù)效應(yīng)分析確定最佳提取組合為A2B1C1D2，即提取溫度60 ℃，提取時間2 h，提取次數(shù)2次，料液比 1 g ∶[G-3]12 mL。經(jīng)重復(fù)試驗，A2B1C1D2組合提取率為 141 g/kg。

23荔枝草提取物的分析結(jié)果

231紅外吸收光譜分析結(jié)果

由圖2可知，荔枝草提取物與高車前苷對照品的紅外光譜比較接近，但在特征骨架振動區(qū)域內(nèi)有少量差別，如某些吸收峰出現(xiàn)了少量位移。對各組分進行拓撲學(xué)比較后發(fā)現(xiàn)兩者峰形基本相似，說明其所含物質(zhì)相同，只是在量上有所差異。根據(jù)荔枝草提取物紅外圖譜推斷：3 400 cm-1（—OH，2 930 cm-1（—CH2—、—CH3，1 735 cm-1（烷基醛，1 460 cm-1（Ar，1 294 cm-1（Ar—O—C，900～690 cm-1（Ar。綜上分析，荔枝草有—OH、—CH2—、—CH3—、烷基醛、苯環(huán)、Ar—O—C、芳烴等官能團， [JP2]表明荔枝草提取物為黃酮類物質(zhì)高車前苷。在本研究中，荔枝草提取物為混合物體系，而紅外吸收光譜圖是多種物質(zhì)光譜疊加endprint