高效液相色譜法測(cè)定土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留

李國(guó)鋒　魏瑞成　王冉

摘要：為了監(jiān)測(cè)土壤中有機(jī)化合物污染狀況，建立同時(shí)測(cè)定土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留量的高效液相色譜方法。土壤樣品以甲醇和水（4 ∶[G-3]1作為溶劑進(jìn)行提取，漩渦混勻后再進(jìn)行超聲提取、離心過(guò)濾，在240 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，間羥基苯甲酸與聯(lián)苯得到很好的分離，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在03～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥099，保留時(shí)間分別為28、80 min；05～100 μg/mL添加濃度范圍內(nèi)，聯(lián)苯、間羥基苯甲酸在土壤中的平均回收率分別為8903%～10304%、7982%～10048%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為076%～249%、116～457，該方法得到間羥基苯甲酸的定量限為01 μg/mL，聯(lián)苯為02 μg/mL。該方法適用于土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留的同步快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥；土壤；殘留；聯(lián)苯；間羥基苯甲酸；同時(shí)測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)： TQ4502+63文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0316-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：201410235。

作者簡(jiǎn)介：李國(guó)鋒（1972—，男，江蘇東臺(tái)人，副研究員，從事科研管理和食品安全檢測(cè)方法研究。E-mail：gfliguofeng@126com。

目前世界上化學(xué)農(nóng)藥年產(chǎn)量近200萬(wàn)t，約有1000多種人工合成化合物被用作殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、殺藻劑、落葉劑等類(lèi)農(nóng)藥。施用于作物上的農(nóng)藥將附著于作物上，或散落在土壤、大氣和水等環(huán)境中，環(huán)境殘留農(nóng)藥中的一部分又會(huì)被植物吸收，造成農(nóng)藥污染問(wèn)題。其中，聯(lián)苯與間羥基苯甲酸是農(nóng)業(yè)和化工生產(chǎn)中常用的一類(lèi)有機(jī)物。聯(lián)苯是2個(gè)苯基相連形成的化合物，為重要的有機(jī)原料，衍生物包括聯(lián)苯胺、聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚、多氯聯(lián)苯等，其殘留可對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[1-3]，主要損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，高濃度接觸對(duì)呼吸道和眼睛有明顯刺激作用。間羥基苯甲酸用于制備除草劑、殺菌劑，對(duì)人體健康及生態(tài)環(huán)境會(huì)造成一定危害。目前，關(guān)于聯(lián)苯與間羥基苯甲酸的液相、氣相和質(zhì)譜等檢測(cè)方法主要集中在蔬菜、水果、尿液[7]、化妝品[8]和食品[9-11]中，且以單成分測(cè)定為主，而有關(guān)土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留的檢測(cè)方法少有報(bào)道。為了監(jiān)測(cè)土壤中苯類(lèi)化合物污染狀況，本研究建立了同時(shí)測(cè)定土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留的高效液相色譜方法，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全中關(guān)于苯類(lèi)化合物污染問(wèn)題的研究以及評(píng)價(jià)土壤風(fēng)險(xiǎn)具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1材料與方法

11儀器與試劑

Agilent 1100 Series高效液相色譜系統(tǒng)，配備DAD和VWD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司；Q-100DE數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司；HY-4調(diào)速多用振蕩器（江蘇常州國(guó)華電器有限公司；DELTA 320型pH計(jì)和AL204電子分析天平（梅特勒一托利多儀器上海有限公司；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司。

聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥ 990%；間羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥ 990%（美國(guó)Sigma公司；甲醇，色譜純（美國(guó)TEDIA公司；乙腈，色譜純（美國(guó)ROE Scientific Inc；磷酸二氫鈉，分析純（南京化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純（江蘇南京化學(xué)試劑一廠；蒸餾水為雙蒸水。

聯(lián)苯與間羥基苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精確稱(chēng)取聯(lián)苯和間羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，-20 ℃避光存放。

12樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g試樣于50 mL具塞離心管內(nèi)，加入2 mL水和8 mL甲醇，渦旋1 min后，超聲提取20 min，3 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液過(guò)022 μm微孔濾膜后供高效液相色譜測(cè)定。

13色譜條件[JP2]

色譜柱：ORBAX SB-C18（46 mm × 250 mm，5 μm；[JP2]流動(dòng)相：005 mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)pH值至35 ∶[G-3]甲醇=35 ∶[G-3]65（V/V；流速：10 mL/min。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)為240 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。上述液相色譜操作條件，可根據(jù)不同儀器特點(diǎn)，適當(dāng)調(diào)整操作參數(shù)以期獲得最佳效果。

14樣品添加回收率和精密度測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g空白土壤樣品，置于50 mL具塞離心管內(nèi)，分別加入一定體積的聯(lián)苯與間羥基苯甲酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成05、10、100 μg/mL的加標(biāo)樣品，混勻后靜置，按照“12”節(jié)的提取方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

21色譜條件優(yōu)化

211檢測(cè)波長(zhǎng)的確定利用紫外分光光度計(jì)對(duì)聯(lián)苯和間羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（200～400 nm。結(jié)果表明，聯(lián)苯與間羥基苯甲酸在220 nm處有最大吸收峰，通過(guò)在二極管陳列檢測(cè)器（DAD上設(shè)定220、240、260、280 nm對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，樣品基質(zhì)干擾少，而儀器的響應(yīng)值也較高。因此，為了獲得準(zhǔn)確的目標(biāo)物和降低樣品檢測(cè)限，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

212流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)比較了乙腈-磷酸二氫鈉（005 mol/L和甲醇-磷酸二氫鈉（005 mol/L二元體系作為流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，在乙腈-磷酸二氫鈉（005 mol/L體積比為65 ∶[G-3]35時(shí)，聯(lián)苯的出峰時(shí)間在24 min左右，間羥基苯甲酸的出峰時(shí)間在47 min左右，分離度一般。當(dāng)加大磷酸二氫鈉的比例后，聯(lián)苯的出峰時(shí)間往后推移，而間羥基苯甲酸的出峰時(shí)間提前；當(dāng)流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鈉（005 mol/L體積比為40 ∶[G-3]60時(shí)，組分未能出峰。在甲醇-磷酸二氫鈉（005 mol/L體積比為70 ∶[G-3]30時(shí)，聯(lián)苯的出峰時(shí)間在79 min左右，而間羥基苯甲酸則沒(méi)有分離出來(lái)；在甲醇-磷酸二氫鈉（005 mol/L體積比為 65 ∶[G-3]35 時(shí)，間羥基苯甲酸和聯(lián)苯的出峰時(shí)間分別為28 min和 80 min 左右；當(dāng)甲醇-磷酸二氫鈉（005 mol/L體積比為60 ∶[G-3]40時(shí)，聯(lián)苯的出峰時(shí)間在114 min左右，分析時(shí)間較長(zhǎng)。流動(dòng)相的pH值對(duì)目標(biāo)化合物的分離有影響，用磷酸調(diào)整流動(dòng)相中磷酸二氫鈉溶液的pH值至35時(shí)，各組分保留時(shí)間穩(wěn)定，且峰形好，分離度佳，10 min內(nèi)2組分可完全分離，有效地縮短了分析時(shí)間，因此選用甲醇-磷酸二氫鈉（005 mol/L，pH值為35體積比為65 ∶[G-3]35作為流動(dòng)相組成，以提高檢測(cè)的靈敏度和效率。endprint

22樣品前處理?xiàng)l件的選擇

221提取溶液的選擇本研究參考文獻(xiàn)[6，11-13]以及聯(lián)苯、間羥基苯甲酸的理化性質(zhì)，采用了多種溶劑及其組合對(duì)土壤添加樣品進(jìn)行提取效果比較。樣品用體積比為4 ∶[G-3]1的乙腈和水提取時(shí)，提取液中雜質(zhì)較多，雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重；用體積比為3 ∶[G-3]2的甲醇和水提取時(shí)，提取率和回收率較低；用體積比為4 ∶[G-3]1的甲醇和水提取時(shí)，樣品提取回收率高，雜質(zhì)干擾少。根據(jù)上述結(jié)果，試驗(yàn)選擇體積比為4 ∶[G-3]1的甲醇和水組合作為提取溶劑進(jìn)行研究。

222提取條件的選擇參照文獻(xiàn)[14]，比較加入提取溶液的土壤樣品在振蕩器振蕩20 min和超聲波提取20、30 min條件下的提取效果，結(jié)果表明超聲波提取的效果要優(yōu)于振蕩器振蕩，而超聲波20 min和30 min的提取效果并無(wú)顯著差異。試驗(yàn)采用超聲波提取的方法。

23方法的線(xiàn)性與樣品色譜圖

231標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性關(guān)系將配置好的100 μg/mL聯(lián)苯及間羥基苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為03、05、10、20、40、100、150 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“13”節(jié)所選定的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，每個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。以峰面積定量，對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，表明聯(lián)苯和間羥基苯甲酸在03～150 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積（y與進(jìn)樣濃度（x 線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)≥099。

232色譜圖和保留時(shí)間在試驗(yàn)選定的色譜條件下，測(cè)得間羥基苯甲酸與聯(lián)苯的保留時(shí)間分別為28、80 min。色譜峰形較好，雜質(zhì)峰與分析物峰分離度較好（圖3。

[F（W11][TPLGF1tif][F]

[F（W11][TPLGF2tif][F]

[F（W29][TPLGF3tif；S+4mm][F]

24方法的回收率、精密度和定量限

樣品添加按照“14”節(jié)所述方法進(jìn)行，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。按“12”節(jié)所述前處理方法制備樣品，按“13”節(jié)所述方法進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1、表2，聯(lián)苯回收率為8903%～10304%，間羥基苯甲酸回收率為7982%～10048%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。分析方法在不同加標(biāo)濃度下具有很好的回收率和穩(wěn)定性。按照定量限的定義，即分析方法能夠以合理的精確度和回收率從樣品的背景信號(hào)中檢測(cè)出待測(cè)物存在時(shí)需要的最低濃度[15-16]，本方法得到間羥基苯甲酸的定量限為01 μg/mL，聯(lián)苯為02 μg/mL。

[F（W11][HT6H][J]表1土壤樣品中聯(lián)苯的添加回收率[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]添加濃度（μg/mL測(cè)定濃度（μg/mL回收率（%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（%

[BHDG12，W62，W72。3DWW]05 0484 8 9696249

[BHDW]0503 4 10067

0508 4 10169

10 1025 3 10253076

1030 4 10304

1015 2 10152

100 8903 4 8903124

8967 6 8968

9121 3 9121[HJ][BG）F][F）]

[F（W12][HT6H][J]表2土壤樣品中間羥基苯甲酸的添加回收率[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]添加濃度（μg/mL測(cè)定濃度（μg/mL回收率（%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（%

[BHDG12，W62，W72。3DWW]05 0490 2 9805141

[BHDW]0502 4 10048

0502 4 10048

10 0976 4 9764116

0964 2 9642

0954 1 9541

100 7981 6 7982457

8016 2 8016

8072 0 8072[HJ][BG）F][F）]

3結(jié)論

本研究建立了同步快速測(cè)定土壤中聯(lián)苯與間羥基苯甲酸殘留的高效液相色譜方法，用甲醇-水（體積比4 ∶[G-3]1和超聲波的方法提取試樣中殘留的目標(biāo)物，離心分離后供儀器測(cè)定，該方法前處理步驟簡(jiǎn)單，凈化效果理想，分離度和重現(xiàn)性好。通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證了本方法的實(shí)用性，能為土壤中該類(lèi)化合物殘留檢測(cè)新方法的建立提供參考價(jià)值。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[1][（#]趙紅斌，楊銀書(shū)，劉旭東，等 多氯聯(lián)苯對(duì)大鼠睪丸c-fos、c-Myc 和β-catenin表達(dá)的影響[J] 中華男科學(xué)雜志，2011，17（2：126-130

[2]馬慧，葛元新，喻文熙，等 上海西郊農(nóng)田土壤中多氯聯(lián)苯分布特征及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J] 北方環(huán)境，2011，23（11：54-55

[3]Cachada A， Lopes L V， Hursthouse A S，et al The variability of polychlorinated biphenyls levels in urban soils from five European cities[J] Environmental Pollution，2009，157（2： 511-518

[4]沈靜，李明，艾爾肯·依不拉音，等 高效液相色譜法測(cè)定果蔬中殘留的噻苯咪唑、鄰苯基苯酚及聯(lián)苯[J] 藥物分析雜志，2007，27（6：921-924

[5]Saad B， Haniff N H， Saleh M I，et al Determination of ortho-phenylphenol， diphenyl and diphenylamine in apples and oranges using HPLC with fluorescence detection[J] Food Chemistry， 2004， 84（2： 313-317endprint

[6]陳皚，何喬桑，王萍亞，等 固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定水果和果醬中的6種對(duì)羥基苯甲酸酯[J] 色譜，2009，27（6：804-808

[7]Bravo R， Caltabiano L M， Fernandez C，et al Quantification of phenolic metabolites of environmental chemicals in human urine using gas chromatography-tandem mass spectrometry and isotope dilution quantification[J] Journal of Chromatography B， Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences， 2005，820（2： 229-236

[8]沈昊宇，應(yīng)麗艷，曹云峰，等 固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中的鄰苯二甲酸酯和對(duì)羥基苯甲酸酯[J] 色譜，2007，25（2：272-275

[9]汪雋，范必威，許淑霞 固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定乳制品中對(duì)羥基苯甲酸酯[J] 食品科學(xué)，2008，29（7：328-331

[10][（#]王萍亞，周勇，黃鸝，等 高效液相色譜法測(cè)定醬腌菜中6種對(duì)羥基苯甲酸酯[J] 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，27（4：425-429

[11]文君，繆紅，王鮮俊 高效液相色譜法測(cè)定醬油、醋中對(duì)羥基苯甲酸乙酯[J] 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2001，11（3：318-318

[12]吳艷芳，徐家俊，李治國(guó)，等 甲基磺草酮的高效液相色譜分析[J] 農(nóng)藥，2009，48（3：183-184

[13]袁張燊，高永民，顏廷英 HPLC法測(cè)定甲基磺草酮原藥的含量[J] 河北化工，2008，31（11：71-72

[14]李躍紅，馬永民 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牙膏中苯甲酸和4種對(duì)羥基苯甲酸酯[J] 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10（4：439-440

[15]Boon V， Glass B， Nimmo A High-performance liquid chromatographic assay of indomethacin in porcine plasma with applicability to human levels[J] J Chromatogr Sci，2006，44：41-44

[16]Wei R C， Ge F， Chen M，et al Occurrence of ciprofloxacin， enrofloxacin， and florfenicol in animal wastewater and water resources[J] Journal of Environmental Quality，2012，41（5：1481-1486[HJ][FL]endprint