(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

水溶性有機(jī)試劑萃取杜氏藻中的β-胡蘿卜素

惠伯棣,許 岱,宮 平,高 潔

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

使用水溶性有機(jī)溶劑建立適用于杜氏藻中β-胡蘿卜素萃取的方法。以乙酸乙酯為參比,用丙酮、甲醇、乙醇和四氫呋喃4 種水溶性有機(jī)溶劑,對(duì)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的杜氏藻體在室溫條件下分別進(jìn)行萃取。用C18-高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)和C30-HPLC分別測(cè)定萃取物中β-胡蘿卜素含量及其幾何異構(gòu)體的組成。通過比較不同溶劑萃取的β-胡蘿卜素含量和所消耗的溶劑體積,篩選出適合食品工業(yè)生產(chǎn)中使用的水溶性萃取溶劑。在進(jìn)一步考慮各溶劑的食品安全性之后,確定乙醇為最適溶劑。使用乙醇作為萃取溶劑,能夠從每毫克(干質(zhì)量)藻體中萃取得到β-胡蘿卜素0.32 μg。其中,總順式異構(gòu)體的比例占20.21%(m/m)。隨后,使用4 種碳水化合物和1 種蛋白質(zhì)水解酶對(duì)藻體的細(xì)胞壁和膜進(jìn)行破壞。觀察原料酶解對(duì)β-胡蘿卜素萃取量和溶劑消耗的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,原料酶解可導(dǎo)致其中β-胡蘿卜素的損失,并對(duì)溶劑消耗無明顯改進(jìn),不建議采用。

杜氏藻；β-胡蘿卜素；水溶性有機(jī)溶劑；酶；幾何異構(gòu)；高效液相色譜

β-胡蘿卜素是一種類胡蘿卜素。其半系統(tǒng)命名和習(xí)慣命名分別為：β,β-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素的分子由中央共軛雙烯鏈和六元環(huán)末端基團(tuán)組成。由于中央共軛雙烯鏈中存在9 個(gè)共軛雙鍵,β-胡蘿卜素分子在理論上可存在多種幾何異構(gòu)體(E/Z-異構(gòu)體)。在自然界中,常見的幾何異構(gòu)體包括全反式異構(gòu)體和9-順-異構(gòu)體等。其中,全反式異構(gòu)體分子具有對(duì)稱結(jié)構(gòu),見圖1。β-胡蘿卜素為碳?xì)浠衔?極性非常弱,故不溶于水,易溶于許多有機(jī)試劑。因此,其在極性弱的有機(jī)試劑(如苯和己烷等)中具有較好的飽和溶解度。β-胡蘿卜素對(duì)酸、光和熱都不穩(wěn)定[1-2]。β-胡蘿卜素的提取和制備方法是根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特征和物理及化學(xué)性質(zhì)而建立的。

全反式β-胡蘿卜素具有在體內(nèi)淬滅單線態(tài)氧和自由基的作用,可以抑制脂質(zhì)過氧化,也可用于預(yù)防和治療白內(nèi)障等多種由衰老引起的退行性疾病。還有證據(jù)表明,β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體有預(yù)防和治療心血管疾病和癌癥等作用[3-7]。另外,全反式β-胡蘿卜素是VA源,可治療和緩解VA缺乏癥[8]。因此,β-胡蘿卜素被JECFA認(rèn)定為A類食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,可合法使用在保健食品、食品添加劑、藥品以及化妝品中。

杜氏藻(Dunaliella salina)屬藍(lán)藻界、綠藻門、多鞭藻科、鹽生藻類屬的單細(xì)胞光合藻類,又名鹽藻,主要分布在鹽湖、沿海鹽池以及含鹽量高的水中。杜氏藻呈梨形或卵形,具單核、葉綠體和一對(duì)較長(zhǎng)的鞭毛,沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁。杜氏藻細(xì)胞內(nèi)可積累大量的類胡蘿卜素,達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的14%(m/m),其中大部分為β-胡蘿卜素。因此,它成為了商業(yè)化生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素重要原料[9]。杜氏藻中β-胡蘿卜素組分有一個(gè)顯著的的特征：含有大量的順式異構(gòu)體。已有報(bào)道,我國(guó)內(nèi)蒙地區(qū)生長(zhǎng)的杜氏藻中含有11 種類胡蘿卜素及幾何異構(gòu)體。其β-胡蘿卜素主要包括：7-順式、9-順式、15-順式、全反式4 種異構(gòu)體[10]。

從杜氏藻中萃取類胡蘿卜素的方法已有報(bào)道。石斌等[11]從藻粉中萃取類胡蘿卜素時(shí),首先將藻粉用4 g/100 mL的NaOH-甲醇溶液在60～70 ℃條件下皂化1 h,再用1∶1(V/V)的石油醚(沸程：60～90 ℃)與乙醇混合溶劑反復(fù)萃取,收集醚相,用水洗到中性,在50～60 ℃條件下減壓濃縮,濃縮液過Al2O3或MgO柱,用石油醚與丙酮混合溶劑做洗脫劑,可得具有一定純度的β-胡蘿卜素組分。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于萃取前可除去產(chǎn)物中的葉綠素,不足之處在于原料的堿處理可能導(dǎo)致制備成本的升高。對(duì)于新鮮原料,徐貴義等[12]先在藻液中加入FeCl3,使藻絮凝,靜止后得到藻糊。在藻糊中直接加入乙酸乙酯,在40～50 ℃條件下進(jìn)行萃取,蒸發(fā)濃縮萃取液,得到β-胡蘿卜素晶體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以省去原料干燥步驟,不足之處在于萃取通過界面發(fā)生的,萃取過程的效率不易提高。還有報(bào)道[13]可用石油醚從干藻粉中直接萃取β-胡蘿卜素,稱取一定比例的藻粉和石油醚,加溫至50 ℃,攪拌萃取2～3 次,蒸發(fā)濃縮萃取液,得到結(jié)晶產(chǎn)品。用氧化鎂柱可有效地分離和純化經(jīng)過皂化的杜氏藻萃取物而得到較純的β-胡蘿卜素組分。制備物檢測(cè)方法也是多樣的[14-16]。

本研究的主要目的是采用水溶性有機(jī)溶劑做為萃取溶劑,發(fā)展一種從杜氏藻中萃取β-胡蘿卜素的方法,力求在工業(yè)規(guī)模上可以避免脫水干燥。為此,在本項(xiàng)研究中,首先在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)杜氏藻,獲得藻液,分別用4 種不同的水溶性有機(jī)溶劑直接進(jìn)行萃取,采用紫外-可見分光光度法、C18-高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)、C30-HPLC進(jìn)行組成分析,比較4 種有機(jī)試劑對(duì)β-胡蘿卜素的萃取量和溶劑消耗。同時(shí),觀察用多糖水解酶和蛋白水解酶破壁對(duì)β-胡蘿卜素含量和溶劑消耗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜氏藻（Dunaliella salina）藻種 上海光語(yǔ)生物科技有限公司。

全反式β-胡蘿卜素（C/N:22040-1G-F，純度＞97%） 美國(guó)Sigma公司；海水鹽 日本Formular Distributor股份有限公司；甲醇、四氫呋喃、乙醇、乙酸乙酯（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司；丙酮（分析純） 鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）（均為色譜純） 美國(guó)迪馬公司；果膠酶（60 000 U/mL）、纖維素酶（100 000 U/mL）、木聚糖酶（70 000 U/mL）、β-葡聚糖酶（100 000 U/mL）、蛋白酶（60 000 U/mL）蘇州昆藍(lán)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PU-2080 HPLC泵、UV-2075 HPLC檢測(cè)器 日本Jasco公司；N2000色譜工作站 浙大智達(dá)信息工程有限公司；Carotenoid YMCTMC30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本YMC公司；DiamonsilTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國(guó)迪馬公司；Jebo 25W水草燈 廣東振華電器有限公司；MLS-3750滅菌鍋 日本Sanyo公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)液母液配制

按照表1所示配方配成母液A、B、C、D、E、F、G備用。用海鹽和蒸餾水配成含鹽量3%的人工海水。將人工海水和A、B、C、D、E、F母液放入高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 藻的培養(yǎng)

杜氏藻藻種經(jīng)培養(yǎng)（或稀釋）后，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定密度達(dá)到（9～10）×108個(gè)/L。培養(yǎng)條件:溫度20～23 ℃、pH 7.5；光源:日光燈；光照時(shí)間:14 h/d；光照強(qiáng)度:4 000 lx。在培養(yǎng)3～4 d后藻種顏色由淺變深。

依次加1 mL的A、B、C、D、E、F母液于1 L的人工海水中。用5 mL的一次性針頭吸取G母液，經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后加入1 mL于上述的人工海水中，配成工作液。取3 個(gè)150 mL的滅菌過的具塞三角瓶，每瓶中加入30 mL工作液。將藻種搖勻后用10 mL移液管向上述3 個(gè)三角瓶中分別移入10 mL藻種液，達(dá)到接種密度為藻種與培養(yǎng)液體積比1∶3。

擴(kuò)培條件與藻種培養(yǎng)條件相同。每天搖瓶2～3 次，使藻種保持懸浮狀態(tài)。藻液顏色由淺變深后（一般5 d）可進(jìn)行第2次擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)培的接種比例為藻液與培養(yǎng)液體積比1∶5。后期，擴(kuò)培比例可達(dá)到1∶10（V/V）。

1.3.3 藻密度測(cè)定

采用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中藻密度。

1.3.4 藻干質(zhì)量測(cè)定

取10 mL藻液，在2 500 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。70 ℃條件下烘至質(zhì)量恒定。減質(zhì)量法測(cè)定干物質(zhì)質(zhì)量。

1.3.5 不同溶劑的萃取效率比較

取5支10 mL離心管，分別加入10 mL培養(yǎng)液。在2 500 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，棄去上清液。向各管中分別加入3.5 mL丙酮、甲醇、乙醇、四氫呋喃和乙酸乙酯。用渦旋振蕩器振蕩20 次，靜置后收集第1次萃取液并定容至5 mL。再重復(fù)萃取2次，分別收集、定容萃取液。定容液過0.45 μm濾膜后用于C18-HPLC和C30-HPLC分析。重復(fù)6 次，取平均數(shù)計(jì)算結(jié)果。

1.3.6 原料酶解對(duì)萃取量和溶劑消耗的影響

將藻培養(yǎng)液分別置于50 mL離心管中，在2 500 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，合并收集沉淀物。

取6 支10 mL離心管，每支中加入0.4 g沉淀物，再加入2 mL水和800 U的酶液，用渦旋振蕩器振勻，45 ℃水浴保溫2 h，其間每15 min用渦旋振蕩器振勻一次。在2 500 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。對(duì)照樣品中用水代替酶液。向每個(gè)管中分別加入4 mL乙醇。用渦旋振蕩器振蕩20 次，靜置后收集第1次萃取液并定容至5 mL。再重復(fù)萃取2 次，方法同前。定容液過0.45 μm濾膜后用于C18-HPLC和C30-HPLC的檢測(cè)。重復(fù)6 次，取平均數(shù)計(jì)算結(jié)果。

1.3.7 β-胡蘿卜素組分的C18-HPLC檢測(cè)

采用惠伯棣等[17]的色譜條件：色譜柱：C18DiamonsilTM(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈-水(9∶1,V/V)；流動(dòng)相B：乙酸乙酯；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm；進(jìn)樣量：20 μL；梯度：在20 min內(nèi),流動(dòng)相B的含量由0%線性上升至100%。根據(jù)各組分的光譜特征和色譜行為與已發(fā)表的結(jié)果比較對(duì)其進(jìn)行定性[17]。其中,借助全反式β-胡蘿卜素參比樣品,根據(jù)保留時(shí)間和光譜特征的一致性,對(duì)β-胡蘿卜素組分定性。用參比樣品制作由6點(diǎn)組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2大于99.6%。采用外標(biāo)法定量分析β-胡蘿卜素組分。

1.3.8 β-胡蘿卜素組分幾何異構(gòu)體組成的C30-HPLC檢測(cè)

檢測(cè)方法采用惠伯棣等[18]的色譜條件:色譜柱C30YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A:乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流動(dòng)相B:MTBE；流速: 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm；進(jìn)樣量:20 μL；梯度: 8 min內(nèi)，流動(dòng)相B含量由0%線性上升到55%，之后流動(dòng)相B的含量在55%維持27 min。根據(jù)各組分的光譜特征和色譜行為與已發(fā)表的結(jié)果比較對(duì)其進(jìn)行定性[18]。根據(jù)各β-胡蘿卜素異構(gòu)體組分的峰面積計(jì)算β-胡蘿卜素組分的異構(gòu)體組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻密度和干質(zhì)量的測(cè)定

每次擴(kuò)培前培養(yǎng)液中藻密度為9.43×108個(gè)/L。每升藻液中含有的干物質(zhì)質(zhì)量為0.45 g。

2.2 β-胡蘿卜素組分在C18-HPLC上分離

圖2表明，杜氏藻提取物的C18-HPLC行為與來自高等植物光和組織的相似。根據(jù)色譜圖上各組分的保留時(shí)間、洗脫順序和光譜特征與已發(fā)表的來自高等植物光和組織萃取物的比較，杜氏藻萃取物中各組分定性的推測(cè)結(jié)論見表2。5 種試劑萃取液中均出現(xiàn)6 個(gè)主要的峰。在本項(xiàng)研究中，依據(jù)各組分的洗脫順序和紫外-可見光譜圖與已發(fā)表的數(shù)據(jù)比較，對(duì)C18-HPLC圖上的4 個(gè)組分進(jìn)行了定性:葉黃素、葉綠素C和D以及β-胡蘿卜素。除上述4 個(gè)化合物外，依據(jù)光合生物萃取物在C18柱上的保留時(shí)間段，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其他組分的結(jié)構(gòu)描述只限于指出其含氧與否[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四氫呋喃和乙醇萃取液中葉黃素和β-胡蘿卜素含量較高。乙酸乙酯萃取液中β-胡蘿卜素最低。在色譜圖上的6 個(gè)峰中，葉黃素所占比例最大。這可能是由于在培養(yǎng)過程中，杜氏藻所處的外界環(huán)境條件優(yōu)越，進(jìn)行了大量的光合作用。而β-胡蘿卜素是葉黃素合成的前體。當(dāng)其處于惡劣的環(huán)境中時(shí)，便會(huì)積累大量的β-胡蘿卜素。

已有的證據(jù)表明，在C18-HPLC中，不同的β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體不能得到有效的分離。換言之，在本項(xiàng)研究的色譜條件下，在C18-HPLC上得到的β-胡蘿卜素組分是其幾何異構(gòu)體的混合物，可稱總β-胡蘿卜素組分。圖2表明，萃取物中β-胡蘿卜素組分與其他組分得到了良好的分離。這使β-胡蘿卜素組分的定量具有了可行性。在此色譜條件下，用β-胡蘿卜素參比樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2超過99.96%。

2.3 β-胡蘿卜素中幾何異構(gòu)體的分離

如圖3所示,在本研究的色譜條件下，在C30-HPLC上，不同的β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體能得到有效的分離[18-19]。根據(jù)色譜圖上各組分的保留時(shí)間、洗脫順序和光譜特征與已發(fā)表的來自高等植物光和組織萃取物的比較，杜氏藻萃取物中各組分定性的結(jié)論見表3。圖3表明，萃取物中β-胡蘿卜素組分中幾何異構(gòu)體與其他組分得到了良好的分離。這使β-胡蘿卜素組分中幾何異構(gòu)體的定量具有了可行性。

2.4 不同溶劑萃取的β-胡蘿卜素含量比較

與乙酸乙酯比較，用乙醇和四氫呋喃做溶劑，在3 次萃取后β-胡蘿卜素含量較高，見圖4。用四氫呋喃作為萃取溶劑時(shí)，得率最高。文獻(xiàn)檢索的結(jié)果表明，不含氧類胡蘿卜素在四氫呋喃中有較好的飽和溶解度。因此，這一結(jié)果與已有的報(bào)道[20-21]一致。而不含氧類胡蘿卜素在乙醇中的飽和溶解度有限。形成本項(xiàng)研究結(jié)果的原因可能是萃取溶劑中來自樣品本身的脂溶性組分起到的助溶作用。這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明。

2.5 不同溶劑萃取物中β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體組成比較

將5 種不同試劑的3次杜氏藻萃取液用C30-HPLC分離后,根據(jù)各組分的色譜行為和光譜特征與已發(fā)表的文獻(xiàn)所報(bào)道的結(jié)果作比較[18-19,22],可以觀察到,萃取液中均含有9-順-β-胡蘿卜素、13-順-β-胡蘿卜素和全反式β-胡蘿卜素。其中,以全反式β-胡蘿卜素為主,13-順-β-胡蘿卜素的量極小,定量困難。這與已有的報(bào)道[23-25]相符。圖5表明,溶劑種類對(duì)萃取物中β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體組成影響不大。

2.6 不同溶劑萃取的溶劑消耗比較

圖6顯示了每次萃取的β-胡蘿卜素含量。與乙酸乙酯比較,用乙醇和四氫呋喃做溶劑,第1次萃取液中的β-胡蘿卜素含量明顯多于第2、3次萃取液中的β-胡蘿卜素含量。這表明乙醇和四氫呋喃做溶劑時(shí),溶劑消耗量較少。與之明顯不同,乙酸乙酯第1次與第2次萃取液中β-胡蘿卜素含量相差不多。這說明用乙酸乙酯作溶劑的溶劑消耗量大?？梢杂^察到：4 種試劑在第3次萃取液中所萃取出的β-胡蘿卜素含量急劇下降。因此,可以認(rèn)為4 種溶劑經(jīng)過3 次萃取基本可達(dá)到完全萃取。

2.7 乙醇做萃取溶劑的合理性依據(jù)

考慮到四氫呋喃和丙酮會(huì)給產(chǎn)品帶來不愉快的味道,甲醇的食品安全性較差,故不建議使用。乙醇是GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》所列出的合法使用加工助劑,因此成為在工業(yè)規(guī)模的實(shí)踐中適合的萃取溶劑。按干物質(zhì)含量折算后,從每毫克干質(zhì)量藻體中可萃取到β-胡蘿卜素0.32 μg。其中總順式異構(gòu)體占20.21%(m/m)。

2.8 原料預(yù)處理對(duì)萃取效率的影響

由于植物和藻類細(xì)胞壁和細(xì)胞膜化學(xué)組成包括多種碳水化合物和蛋白質(zhì),在萃取前使用碳水化合物和蛋白水解酶水解細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)部的膜結(jié)構(gòu)以改進(jìn)萃取效率已成為中藥和天然產(chǎn)物萃取技術(shù)中普遍采用的原料前處理內(nèi)容。在本研究中,4種多糖水解酶和1 種蛋白質(zhì)水解酶被用來嘗試破壞藻的細(xì)胞壁和膜。圖7顯示,所有經(jīng)過酶處理的樣品經(jīng)過3 次乙醇萃取所得總β-胡蘿卜素含量均低于對(duì)照樣品。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是酶解破壞細(xì)胞壁和膜可使藻體內(nèi)的β-胡蘿卜素暴露導(dǎo)致?lián)p失；可以認(rèn)為木聚糖酶對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞效果最強(qiáng),導(dǎo)致藻體內(nèi)β-胡蘿卜素的暴露程度最高,損失率也最高。

圖8顯示,與對(duì)照樣品相比,所有經(jīng)過酶處理的樣品的第1次乙醇萃取所得的β-胡蘿卜素含量差別不大。換言之,用酶處理原料對(duì)提高萃取效率、減少溶劑消耗的作用不明顯。

因此,在從杜氏藻中萃取β-胡蘿卜素的過程中,為防止萃取物的損失,不建議采用酶解預(yù)處理原料的措施。

3 結(jié) 論

杜氏藻在實(shí)驗(yàn)室條件下擴(kuò)培、生長(zhǎng)情況良好。用4種水溶性有機(jī)溶劑做為第一萃取溶劑,萃取其中的β-胡蘿卜素組分。用四氫呋喃和乙醇做為萃取溶劑可獲得較高的β-胡蘿卜素含量,并使用較少的溶劑體積。從食品安全性的角度考慮,建議在工業(yè)規(guī)模上采用乙醇作為萃取溶劑。使用酶解法可破壞原料的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu),有利于改善萃取效率。但在酶解過程中,β-胡蘿卜素有一定的損失。因此,在工業(yè)生產(chǎn)中不建議使用。

[1] 惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)輕工出版社, 2005: 1-36.

[2] 汪多仁. β-胡蘿卜素的開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 江西飼料, 2010(5): 1-7.

[3] LIN Fengmin, CHEN Liru, LIN Enhau, et al. Compounds from Wedelia chinensis synergistically suppress androgen activity and growth in prostate cancer cell[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(12): 2521-2529.

[4] MATHEWS-ROTH M, PATHAK M, FITZPATRICK T. Betacarotene therapy for erythropoietic protoporphyria and other photosensitivity diseases[J]. Archives of Dermatology, 1977, 113(9): 1229-1232.

[5] MASAHIRO H, MITSUO H. Carotenoid metabolism in Artemiasalina L.[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 1968, 29(3): 985-994.

[6] 王春波, 藍(lán)孝貞, 張魯平. 鹽藻β-胡蘿卜素對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防作用的研究[J]. 中國(guó)海洋藥物, 1998(1): 7-12.

[7] PALOZZA P, SERINI S, DI NICUOLO F. et al. Prooxidant effects of β-carotene in cultured cells[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2003, 24(6): 353-362.

[8] OLIVER L. Colorimetric analysis of vitamin A and carotene[J]. Methods in Enzymology, 1980, 67: 199-203.

[9] BOROWITZKA M. Microalgae as a source of pharmaceuticals and other biologically active compounds[J]. Journal of Applied Phycology, 1995, 7(1): 3-15.

[10] 李淑清, 索全伶, 楊偉. 吉蘭泰杜氏鹽藻中類胡蘿卜素的分析和鑒定[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2000, 12(6): 56-60.

[11] 石斌, 石軍. 利用鹽生杜氏藻提取β-胡蘿卜素[J]. 精細(xì)化工, 1994, 11(5): 17-19.

[12] 徐貴義. 天然胡蘿卜素的制備方法: 中國(guó), 951157094[P]. 1995-08-31.

[13] 金龍飛, 柳凌艷. 天然β-胡蘿卜素的制備及應(yīng)用[J]. 山西食品工業(yè), 2002(6): 6-9.

[14] 劉敬業(yè), 丘玲, 王亮. 薄層色譜分離測(cè)定烤煙中的β-胡蘿卜素[J]. 云南化工, 1997(2): 49-50.

[15] 李玉環(huán), 王鋒, 劉群山. 皂化法提取番茄紅素的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(8): 146-150.

[16] 婁天軍, 趙功玲, 張炎. 柱層析法純化番茄紅素的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(4): 28-29.

[17] 惠伯棣, 歐陽(yáng)清波, 曾悅. 植物食品中類胡蘿卜素的高壓液相色譜檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2002(5): 72-82.

[18] 惠伯棣, 張艷, 葉珊. 鹽生杜氏藻軟膠囊中β,β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體組成的測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(6): 284-287.

[19] 惠伯棣, 李京, 裴凌鵬. C30-HPLC-PDA分離與鑒定β,β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 252-255.

[20] 張蕊, 蔡靳, 惠伯棣, 等. 一種枸杞中玉米黃素檢測(cè)的方法[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2013(2): 239-245.

[21] 蔡靳, 惠伯棣, 蔣繼志, 等. 一種測(cè)定枸杞鮮果中總類胡蘿卜素含量的方法[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2013(2): 250-256.

[22] 丁靖, 惠伯棣. 食物中類胡蘿卜素的HPLC分析[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2010(4): 256-267; 241.

[23] 李京, 惠伯棣. 秋橄欖果實(shí)中番茄紅素含量與幾何異構(gòu)體組成分析[J].食品工業(yè)科技, 2006, 27(10): 64-65.

[24] 惠伯棣, 李京, 裴凌鵬, 等. C30-HPLC-PDA分離與鑒定β,β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 252-255.

[25] 惠伯棣, 李京, 孫拿拿, 等. 番茄和胡蘿卜中類胡蘿卜素的C30與C18-HPLC分離[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(4): 289-292.

Extraction of β-Carotene from Dunaliella salina by Water-Soluble Organic Solvent

HUI Bodi, XU Dai, GONG Ping, GAO Jie
(Department of Food Science, College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

This study aimed to develop a method for β-carotene extraction from Dunaliella salina by water-soluble organic solvents. In experiments, in reference to ethyl acetate, four water-soluble organic solvents, namely acetone, methanol, ethanol and tetrahydrofuran, were selected as media to extract β-carotene from Dunaliella salina cultured under laboratory conditions. β-carotene and its geometrical isomers in each extract were determined by C18-HPLC and C30-HPLC, respectively. By comparing the extraction efficiency of β-carotene and solvent consumption and meanwhile considering food safety, ethanol was selected as the most suitable medium for industrial practice. By using ethanol as the extraction medium, 0.32 μg of β-carotene was extracted from 1 mg of dried Dunaliella salina with 20.21% (m/m) of total Z-isomers. Four carbohydrates and one protease were then employed to destroy the cell wall and membrane of algae. The influences of enzymatic hydrolysis of raw material on the extraction efficiency of β-carotene and solvent consumption were observed. Data obtained from this investigation suggested that enzymatic hydrolysis of Dunaliella salina resulted in loss of β-carotene amount and exhibited no improvement in solvent consumption. It is therefore not considered to be applied.

Dunaliella salina; β-carotene; water-soluble organic solvent; enzyme; geometrical isomer; HPLC

TS202.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510036

2014-10-18

惠伯棣(1959—),男,教授,博士,研究方向?yàn)轭惡}卜素化學(xué)及生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn