竇玉淼，張 飛，張 翼，陳雅蘅，周幗萍

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北 武漢 430023)

武漢市售茶中2種食源性致病菌的檢測(cè)與分析

竇玉淼，張 飛，張 翼，陳雅蘅，周幗萍*

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北 武漢 430023)

為了解市售茶葉中菌落總數(shù)和2 種食源性致病菌（蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌）的檢出情況，根據(jù)國(guó)標(biāo)對(duì)武漢地區(qū)市售的46 份茶葉樣品進(jìn)行菌落總數(shù)和2 種食源性致病菌的初步分離和鑒定，分別用16S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法鑒別蠟樣芽孢桿菌，用16S rDNA和fusA序列分析對(duì)疑似克羅諾桿菌的分離株進(jìn)行鑒定，進(jìn)而比較和分析不同產(chǎn)地和類別間微生物的檢出情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌在市售茶葉中檢出率極高，達(dá)97.9%，而且其數(shù)量約占細(xì)菌總數(shù)的6.0%。鑒定出3 株阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter），其檢出率達(dá)6.5%，僅占細(xì)菌總數(shù)的0.1%～3.2%。花草茶中細(xì)菌總數(shù)最高，也是唯一檢出克羅諾桿菌的茶類；發(fā)酵茶中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量最高，均超過(guò)1 100 MPN/g。不同產(chǎn)地茶葉在這3 個(gè)微生物指標(biāo)上有顯著差異。當(dāng)茶及其深加工產(chǎn)品和其他食品原輔料混搭成新產(chǎn)品時(shí)，這2 種食源性致病菌可能帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)隱患。

茶；細(xì)菌總數(shù)；蠟樣芽孢桿菌；克羅諾桿菌；檢測(cè)；鑒定

隨著茶葉深加工技術(shù)的發(fā)展，茶不僅作為傳統(tǒng)飲品，也以各種形式（浸提物、膏、粉、湯等）添加到多種食品中，特別是各種抹茶糕點(diǎn)、冰激凌等在市場(chǎng)上廣受歡迎；同時(shí)向茶湯中添加多種配料，成為奶茶、珍珠奶茶等成為風(fēng)尚。傳統(tǒng)的飲用方法，因茶葉水分活度低、沖泡溫度高、沖泡后一般立即飲用，不含糖類或蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)物（或含量極為低微），一般不存在微生物方面的食品安全隱患。但是一旦混搭其他食品，特別是糕點(diǎn)、奶制品就可能帶入微生物隱患。

因水分活度低，茶葉及其深加工產(chǎn)品中芽孢桿菌、耐干燥的細(xì)菌和霉菌為其中優(yōu)勢(shì)菌群[1]。以往的研究比較重視茶葉中真菌、毒素的檢測(cè)以及腸桿菌超標(biāo)等有害微生物污染[2-3]。但是研究發(fā)現(xiàn)茶葉中有2 種食源性致病菌:蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌（原阪崎腸桿菌）檢出率較高，而且部分樣品中含菌量很高[4]。這2 種條件致病菌在傳統(tǒng)飲茶習(xí)慣中危害很小，但是一旦和淀粉、乳制品混搭，這兩者就可能導(dǎo)致很高的安全風(fēng)險(xiǎn)。為此，特收集市售茶以調(diào)查菌落總數(shù)及這兩種食源性致病菌的情況。

蠟樣芽孢桿菌的鑒定目前有很大爭(zhēng)議。蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌（B. cereus group）原來(lái)包括了蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、炭疽芽孢桿菌（B. anthracis）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、蕈狀芽孢桿菌（B. mycoides）和假蕈狀芽孢桿菌（B. pseudomycoides）、韋氏芽孢桿菌（B. weihenstephanensis）6 個(gè)種，2013又增加了B. cytotoxicus[5]。由于該群內(nèi)各種間在基因組上的高度一致，必須采用非常復(fù)雜的生理生化反應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)才能鑒定，加上一些新種的定義還存在很大爭(zhēng)議，要準(zhǔn)確鑒定蠟樣芽孢桿菌幾乎成為非常復(fù)雜任務(wù)；現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)都未與最新分類系統(tǒng)接軌，同時(shí)很多研究者也質(zhì)疑標(biāo)準(zhǔn)中所采用生理生化法的繁瑣和準(zhǔn)確性[6]；同時(shí)因?yàn)橄灅友挎邨U菌的很多毒素基因，除嘔吐毒素合成相關(guān)基因外，都位于基因組內(nèi)，并廣泛分布在蠟樣芽孢桿菌群各種菌株中，所以很多學(xué)者在探討食品安全問(wèn)題時(shí)也將蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌一起討論[7-8]。本研究鑒定的蠟樣芽孢桿菌，嚴(yán)格意義上僅鑒定到蠟樣芽孢桿菌群，排除了蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和假蕈狀芽孢桿菌，但是未區(qū)分其他4 個(gè)種。

Iversen等[9-10]根據(jù)表型和基因型特征將阪崎腸桿菌成立一個(gè)新屬-克羅諾屬Cronobacter，并分為6 個(gè)種，2013年7月又改為10 個(gè)種[11-12]。阪崎腸桿菌的常規(guī)鑒定和分類主要依據(jù)生理生化性質(zhì)，但已發(fā)現(xiàn)生化分型與分子分型結(jié)果有偏差，已不再適用于鑒別該屬下種的劃分。我國(guó)國(guó)標(biāo)與國(guó)際最新分類體系出現(xiàn)了偏離，這不僅是分類學(xué)的問(wèn)題，也涉及到安全性評(píng)價(jià)。因?yàn)槟壳鞍l(fā)現(xiàn)只有阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii），C. turicensis和C. malonaticus對(duì)人類有感染力，尤其值得重視的是C. sakazakii與嬰幼兒腦膜炎密切相關(guān)[13-14]?？肆_諾桿菌對(duì)嬰幼兒危害很大，所以對(duì)嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的監(jiān)控和檢測(cè)很多，但是國(guó)內(nèi)尚未重視其他食品原輔料中克羅諾桿菌的檢出情況，而國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌實(shí)際上在食品和環(huán)境中廣泛存在。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基及試劑

于2013年9—12月購(gòu)自湖北省武漢市大型茶葉批發(fā)市場(chǎng)。共采集46 個(gè)樣，包括不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、發(fā)酵茶及花草茶。

培養(yǎng)基:平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（mannitol-egg-yolk- polymyxin agar，MYP）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，mLST-Vm）。

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑（2×Taq PCR MasterMix） 北京Aidlab公司；PCR反應(yīng)產(chǎn)物由蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯和修正后提交給GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 儀器與設(shè)備

T-Gradient Thermoblock PCR儀 德國(guó)Biometra公司；DYY8B型穩(wěn)壓電泳儀 北京市六一儀器廠；GBOX-H12-E-M自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng) 英國(guó)Syn-gene公司；80i正置熒光相差顯微鏡（YS100） 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中微 生物的檢測(cè)與計(jì)數(shù)

克羅諾桿菌的檢測(cè):參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》[15]；蠟樣芽孢桿菌的測(cè)定:參考GB/T 4789.14—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn):蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[16]；菌落總數(shù)的測(cè)定:參考GB 4789.40—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):菌落總數(shù)測(cè)定》[17]。菌落總數(shù)采用梯度稀釋用PCA培養(yǎng)基檢測(cè)；蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌采用MPN法。

1.3.2 克羅諾桿菌疑似菌株的16S rDNA及fusA序列分析

fusA序列分析（http://pubmlst.org/cronobacter/）數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站所列Cronobacter細(xì)菌的管家基因中的fusA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由蘇州金唯智公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)16S rDNA的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯和修正后提交給GenBank和獲得編號(hào)，并用Mega 6.0軟件進(jìn)行聚類分析；fusA序列提交MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得等位基因號(hào)，并用Splitstree4軟件進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)-PCR檢測(cè)

16S-23S rDNA 間隔區(qū)引物:ITS-16S-1392-S-15（GNACACACCGCCCGT）；ITS-23S-206-A-21（NCTTAGATGTTTCAGTTCVCY）。PCR擴(kuò)增體系: 2×Taq PCR Mix 25 μL；上下游引物各1 μL；DNA模板5 μL；加水至50 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃、1 min；95 ℃、45s；55 ℃、1 min；72 ℃、1 min 30 s；循環(huán)30 次；后延伸72 ℃、5 min[12-13]。

1.3.4 蠟樣芽孢桿菌群細(xì)菌的形態(tài)觀察

染色后用顯微鏡觀察有無(wú)伴孢晶體排除蘇云金芽孢桿菌；在PCA和溶菌肉湯平板上是否根狀生長(zhǎng)，排除蕈狀和假蕈狀芽孢桿菌；確定蠟樣芽孢桿菌的管數(shù)，由最大或然數(shù)（most probable number，MPN）表計(jì)算蠟樣芽孢桿菌的MPN值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌的鑒定

挑取在MYP培養(yǎng)基上具有典型蠟樣芽孢桿菌落特征的分離株進(jìn)行16S/23S rDNA ITS-PCR，如圖1所示，在500、750 bp有2 條特征帶，和標(biāo)準(zhǔn)株一致，視為蠟樣芽孢桿菌。

2.2 克羅諾桿菌的鑒定

克羅諾桿菌在mLST-Vm培養(yǎng)基上具有典型菌落同時(shí)在TSA培養(yǎng)基上產(chǎn)黃色菌落者，視為疑似菌株，通過(guò)16S rDNA序列分析進(jìn)行屬的鑒定，進(jìn)而用fusA序列分析對(duì)已經(jīng)鑒定為克羅諾桿菌的菌株進(jìn)行種的鑒定。

圖2是Mega 6.0用鄰近法構(gòu)建的基于16S rDNA序列分析的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，圖中Bootstrap為200，圖下標(biāo)尺表示每200 個(gè)堿基序列中有一個(gè)堿基替換，括號(hào)中為GenBank登錄號(hào)。

從5 個(gè)花草茶樣品中共分離到5 個(gè)疑似克羅諾桿菌的分離株，進(jìn)行16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自16和20號(hào)樣本中的2 個(gè)菌株可以鑒定為埃希氏菌屬（Escherichia spp.），有3 個(gè)菌株CSWHPU-39、40、41（分別來(lái)自21、22、23樣品）可鑒定為克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）。

16S rDNA序列分析被公認(rèn)為微生物鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其結(jié)果只能準(zhǔn)確到屬，種的鑒定還需要參考其他方法。截至2014年7月19日在Cronobacter MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了自1950年以來(lái)全球超過(guò)36 個(gè)國(guó)家812 個(gè)菌株共293 個(gè)ST(sequence type)型的信息,是該屬細(xì)菌最大、最全面的數(shù)據(jù)庫(kù)。用Splitstree 4分析數(shù)據(jù)庫(kù)中7 個(gè)管家基因的所有序列，發(fā)現(xiàn)fusA基因是進(jìn)化最穩(wěn)定的基因，但其序列多樣性又可區(qū)分最新分類系統(tǒng)中克羅諾桿菌的10 個(gè)種及其進(jìn)化關(guān)系，所以選用fusA基因序列分析做菌種鑒定。用數(shù)據(jù)庫(kù)中所有100 個(gè)fusA等位基因做出進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。據(jù)此,CSWHPU-39為fusA_7,鑒定為丙二酸鹽克羅諾桿菌C. malonaticus；CSWHPU-40為fusA_73,鑒定為C. pulveris；CSWHPU41為fusA_41,鑒定為都柏林克羅諾桿菌C. dublinensis。

2.3 市售茶葉中細(xì)菌總數(shù)和2 種食源性致病菌的檢出情況

從表1可見(jiàn),蠟樣芽孢桿菌在46 份茶葉樣品中檢出率高達(dá)97.9%,僅有一個(gè)產(chǎn)自安徽的桂花茶樣品中低于MPN檢測(cè)下限(3 MPN/g),33 份樣品(71.7%)含菌量都超出MPN檢測(cè)上限(1 100 MPN/g),最高可超過(guò)細(xì)菌總數(shù)的33.4%,是茶葉樣品中不可忽視的優(yōu)勢(shì)菌；而另一個(gè)食源性致病菌-阪崎腸桿菌則檢出率僅為6.5%(3/46),只有3 份樣品安徽出產(chǎn)的花草茶樣品檢出了阪崎腸桿菌,僅為細(xì)菌總數(shù)的0.1%～3.2%,并非優(yōu)勢(shì)菌群。

2.4 不同種類茶葉之間的比較

根據(jù)茶葉原料和加工工藝,可以大致把茶分為：花草茶、不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶和發(fā)酵茶4 種類別。為方便計(jì)算,將所有蠟樣芽孢桿菌數(shù)量中大于1 100 MPN/g,都按照1 100 MPN/g來(lái)計(jì)算。比較這4 種不同種類茶葉中微生物的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)花草茶的細(xì)菌總數(shù)明顯高于其他品種,達(dá)到(23 264±11 919) CFU/g,蠟樣芽孢桿菌數(shù)量?jī)H次于發(fā)酵茶((898±414) MPN/g),花草茶也是4 種茶葉中唯一檢出克羅諾桿菌的種類；發(fā)酵茶的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量顯著高于其他品種,均大于1 100 MPN/g,而半發(fā)酵茶細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)量都低于其他品種,不發(fā)酵茶其次。詳見(jiàn)圖4、5。

2.5 不同產(chǎn)地之間的比較

因?yàn)槲覈?guó)茶葉產(chǎn)地甚多，武漢市售茶葉的采樣過(guò)程中安徽（10）、湖北（12）和福建（11）樣本數(shù)量相當(dāng)，其他10 個(gè)?。ǖ貐^(qū)）樣本數(shù)量過(guò)低（≤2），所以僅比較這3 個(gè)產(chǎn)地的情況。由圖6、7可知,這3 個(gè)產(chǎn)地的茶葉間在3 個(gè)微生物指標(biāo)上有著顯著差異，福建茶葉在細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)上都比其他2 個(gè)產(chǎn)地低，湖北茶葉在細(xì)菌總數(shù)（（22 083±15 503） CFU/g）略微高于安徽茶葉（（21 154±12 191） CFU/g），但是其蠟樣芽孢桿菌數(shù)量（（921±418） MPN/g）卻略微低于安徽茶葉（（942±367） MPN/g）。而安徽又是所有產(chǎn)地中唯一檢出克羅諾桿菌的省份。

微生物指標(biāo)不僅與產(chǎn)地有關(guān)，與各地生產(chǎn)的品種也有很大的關(guān)系，如福建生產(chǎn)半發(fā)酵類茶（鐵觀音等），而湖北和安徽的不發(fā)酵茶和花草茶品種較多。正如2.4節(jié)所討論，茶葉的種類對(duì)微生物指標(biāo)影響很大。

3 討 論

前期實(shí)驗(yàn)中曾同時(shí)采用MYP和PCA培養(yǎng)基直接稀釋平板計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)菌總數(shù)和蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)部分樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量高于細(xì)菌總數(shù)?？赡苁且?yàn)镸YP培養(yǎng)基是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的鑒別培養(yǎng)基，非常適合蠟樣芽孢桿菌類細(xì)菌生長(zhǎng)，而PCA是常規(guī)培養(yǎng)基的緣故。但是這樣的結(jié)果沒(méi)法測(cè)算蠟樣芽孢桿菌占細(xì)菌總數(shù)的比例，故此改用了MPN法。MPN法中多數(shù)樣品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量都超出了MPN法的上限1 100 MPN/g，也不能精確計(jì)量蠟樣芽孢桿菌數(shù)量。這2 種情況都反映出蠟樣芽孢桿菌在茶葉樣品數(shù)量變化較大，某些樣品中所占比例非常高，屬于優(yōu)勢(shì)菌群。特別是所有的發(fā)酵茶樣品中蠟樣芽孢桿菌均高于1 100 MPN/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不發(fā)酵茶和半發(fā)酵茶，說(shuō)明茶葉的發(fā)酵過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量有增長(zhǎng)[18]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)市售茶葉中克羅諾桿菌檢出率不高，陽(yáng)性樣品中含菌量也不高，未發(fā)現(xiàn)對(duì)嬰幼兒高毒力的阪崎克羅諾桿菌，但是存在對(duì)成人（免疫力差人群）有感染能力的丙二酸鹽克羅諾桿菌C. malonaticus[19]。

雖然本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有研究茶葉中大腸菌群的數(shù)量和類別，但是在鑒定5 株疑似克羅諾桿菌過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其中2 株（也是花草茶樣品分離株），并非克羅諾桿菌而是埃希氏菌屬，可見(jiàn)一般認(rèn)為對(duì)干燥敏感的腸桿菌科細(xì)菌在茶葉檢出率并不低。

花草茶（包括谷類茶）現(xiàn)在品種越來(lái)越多，也受到市場(chǎng)追捧。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花草茶無(wú)論在細(xì)菌總數(shù)、蠟樣芽孢桿菌和腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量上都很高，甚至比傳統(tǒng)的茶葉類還高。

傳統(tǒng)飲茶習(xí)慣中極少發(fā)生微生物食物中毒的報(bào)道，但是隨著各種花式茶（特別是奶茶）普及和茶粉等深加工產(chǎn)品添加到糕點(diǎn)等食品中，由于大量的糖、淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)豐富的原料加入，加上保質(zhì)期的延長(zhǎng)，可能給食源性致病菌提供了生長(zhǎng)、產(chǎn)毒的機(jī)會(huì)，比如:蠟樣芽孢桿菌在富含淀粉質(zhì)食品中容易生長(zhǎng)，并產(chǎn)生非常穩(wěn)定的嘔吐毒素引起嘔吐型食物中毒[19]；而克羅諾桿菌食物中毒多數(shù)因乳品引起[20]。

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Detection and Analysis of Two Food-Borne Pathogens in Tea Samples from Wuhan Market

DOU Yumiao, ZHANG Fei, ZHANG Yi, CHEN Yaheng, ZHOU Guoping*
(School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The objective of this study was to detect the aerobic plate count, and isolate and identify two food-borne pathogens (Bacillus cereus and Cronobacter) in tea samples collecte d from local markets in Wuhan according to the Chinese national standards. Bacillus cereus was identifi ed by PCR analysis of 16S rDNA internal transcribed spacer (ITS) sequence and Cronobacter by 16S rDNA and fusA sequence analysis. We further compared the detection rates of both bacterial pathogens in tea samples from different producing areas and in different kinds of tea. Bacillus cereus was detected in 97.9% of the investigated tea samples accounting for about 6.0% of the total bacterial population. Three strains of Conobacter spp. were identifi ed in 6.5% of these tea samples accounting for only 0.1%–3.2% of the total bacterial population. The highest aerobic plate count and Conobacter spp. were found only in herbal tea. Fermented tea had the highest B. cereus counts, exceeding 1 100 MPN/g in all samples. There were signifi cant differences in the three microbial indicators among different tea-producing regions. Thus, the food safety hazards of these food-borne pathogens cannot be ignored, especially when tea is mixed with other materials.

tea; aerobic plate count; Cronobacter; Bacillus cereus; detection; identifi cation

Q939.97

A

10.7506/spkx1002-6630-201510039

2014-08-09

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目中青年項(xiàng)目(Q20111703)；武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2013cx020)；2014年武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目

竇玉淼(1992—),女,學(xué)士,研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：735359310@qq.com

*通信作者：周幗萍(1971—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵與食品安全。E-mail：wjczgp@163.com