潘 廣，章桂明，陳枝楠，程穎慧，向才玉，包先雨，凌杏園,*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科 學(xué)研究院,廣東 深圳 518010)

應(yīng)用LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測大米制品中轉(zhuǎn)基因成分

潘 廣1，章桂明1，陳枝楠2，程穎慧1，向才玉1，包先雨2，凌杏園1,*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科 學(xué)研究院,廣東 深圳 518010)

大米制品中痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測需要特異和超靈敏的檢測方法。本研究以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因大米篩查位點CaMV35S啟動子、NOS終止子和Cry1A基因為目標(biāo)，利用在常規(guī)TaqMan探針中摻入鎖核苷酸提高探針退火溫度和雜交特異性等特點，經(jīng)比較以上位點不同LNA-T aqMan探針實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測效果，建立了針對上述篩查位點的基于LNA-TaqMan探針的新型實時熒光PCR檢測方法。該方法特異性強(qiáng)，檢測靈敏度超高；與普通TaqMan實時熒光PCR方法相比，其反應(yīng)Ct值可提前1～3個循環(huán)（Cry1A位點除外），檢測低限可達(dá)3 pg。該檢測方法可以用以檢測大米制品中常規(guī)實時熒光PCR難以檢測到的痕量轉(zhuǎn)基因大米成分。

大米制品；鎖核酸；鎖核酸探針；實時熒光PCR

大米是我國最主要的主糧之一，其安全性特別是轉(zhuǎn)基因情況倍受百姓關(guān)注。目前，國際上有5 個已批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因水稻品種，它們是拜耳公司研發(fā)的LLRICE06、LLRIC E601和LLRICE62，日本研發(fā)的7Crp#10和伊朗研發(fā)的Tarom molaii+cry1Ab。我國是最早開展轉(zhuǎn)基因水稻研究的主要國家之一，截至2009年，我國有記錄的田間試驗達(dá)4 000多次，其中水稻有480余次[1]；僅國內(nèi)外文獻(xiàn)已披露的我國轉(zhuǎn)基因水稻品系就有Bt汕優(yōu)63、華 恢1號、科豐6號、科豐8號、科螟稻等[2-4]，其中品系Bt汕優(yōu)63和華恢1號于2010年獲農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的生物安全證書。我國迄今未批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因大米的進(jìn)口，也未批準(zhǔn)任何國內(nèi)的轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化種植；因此，國內(nèi)市場以及在出口的大米和米制品中不應(yīng)含有任何的轉(zhuǎn)基因成分。然而，僅在2012年，我國出口到歐盟的大米制品如米粉、米線、米條等被通報檢出非法轉(zhuǎn)基因成分的就達(dá)到32 次之多[5]。這不僅給出口企業(yè)造成了直接的經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是影響了我國出口產(chǎn)品的聲譽(yù)。

出現(xiàn)上述情況，一是因為轉(zhuǎn)基因品種或品系資源在環(huán)境釋放等環(huán)節(jié)存在監(jiān)管上的漏洞；其二是我國轉(zhuǎn)基因水稻未商業(yè)化種植，出現(xiàn)在普通大米中的轉(zhuǎn)基因大米往往是污染造成的，本身含量就很低，加上米制品在加工生產(chǎn)過程中，其基因組DNA高度降解，以目前常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和實時熒光PCR為主的轉(zhuǎn)基因檢測方法往往難以檢出這些痕量的轉(zhuǎn)基因成分。因此，有必要研發(fā)專門針對米制品等加工食品的痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)，以確保對這些大米制品中的轉(zhuǎn)基因成分“檢得出”和“檢的準(zhǔn)”。

L AN-TaqTan探針是一種應(yīng)用于實時熒光PCR的新型的探針。由于其在常規(guī)TaqMan探針中參入了鎖核苷酸（locked nucleotide acid，LAN），大大提高探針與目標(biāo)序列的親和力，提高了探針的Tm值，從而可使探針設(shè)計的更短，進(jìn)而適應(yīng)于超短DNA片段的檢測，因此檢測靈敏度更高[6]。本研究以米制品為材料，以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中篩查轉(zhuǎn)基因大米成分的CaMV35S啟動子、NOS終止子和Cry1A基因為目標(biāo)[7]，設(shè)計和制備了摻入不等鎖核苷酸的超短的LNA-TaqMan探針。通過對不同的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR擴(kuò)增效果比較，篩選得到了檢測上述3 個外源基因的LNA-TaqMan短探針，進(jìn)而建立了針對上述篩查基因的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，特別適于大米制品等加工食品中含上述外源基因的轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

爆米花、旺旺大米餅、旺旺黑米雪餅、旺旺大米海苔、貝殼米粉、東莞米粉、河源米粉、桂林米粉、江西米粉和云南米線均采自超市。

轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品Bt11 歐盟標(biāo)準(zhǔn)局；轉(zhuǎn)基因大米標(biāo)準(zhǔn)品LLRice62、LLRice601 美國美國油脂化學(xué)家協(xié)會；轉(zhuǎn)基因水稻（大米）科豐8號、科豐6號和Bt汕優(yōu)63參照樣品由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；大米制品米粉1、2和3號、東北五常大米、泰國香米及非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因小麥均由本實驗室收集。

實時熒光PCR反應(yīng)用試劑盒TaqMan Enviromental Master Mix 2.0 美國Applied Biosystems公司。CTAB核酸提取液和沉淀液等均由實驗室自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；渦旋震蕩儀 德國IKA公司；恒溫水浴鍋 北京六一公司；NanoDrop2000c分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；7900實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystem公司；純水器 美國Millipore純水器。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與制備

DNA提取方法采用GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測:核酸提取純化方法》中的CTAB-2方法[8]，用NanoDrop2000c測定其濃度和質(zhì)量。DNA質(zhì)量濃度按照下式計算:

C=A×N×50

式中:C為DNA質(zhì)量濃度/（ng/μL）；A為260 nm波長處的吸光度；N為核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260nm/A280nm比值在1.7～1.9之間時，適宜于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 LNA-TaqMan探針和引物

引物序列、LNA-TaqMan探針序列以及鎖核苷酸摻入位置見表1，以上探針和引物均由江蘇碩世生物科技有限公司合成。

1.3.3 實時熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，其中2× TaqMan Enviromental Mix 2.0 10 μL，DNA模板（50 ng/μL）3 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，用雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μL，每個試樣重復(fù)3 次PCR反應(yīng)，同時設(shè)空白對照、陽性對照和陰性對照。

擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7900型實時熒光PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)采用兩步法:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環(huán)。

1.3.4 實時熒光PCR反應(yīng)特異性測定

用2% Bt11、10%科豐6號、100%科豐8號、100%克螟稻、5%Bt汕優(yōu)63、LLRice62、LLRice601、東北大米、泰國香米以及非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因小麥共總計14 個不同轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因樣品測試方法的特異性。

1.3.5 檢測低限的測定

將100%科豐8號轉(zhuǎn)基因大米基因組DNA，用10 倍梯度系列稀釋成10 ng/μL～0.1 pg/μL共6 個質(zhì)量濃度梯度，每PCR反應(yīng)加3 μL，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 次PCR反應(yīng)。發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的最低樣品質(zhì)量濃度或基因組DNA量即該方法的檢測低限。

1.3.6 實時熒光PCR反應(yīng)效率測定

按檢測低限測定方法配制標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品，以樣品擴(kuò)增的Ct值為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品DNA拷貝數(shù)（或濃度）的對數(shù)為X軸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品的Ct值和基因組DNA拷貝數(shù)（或濃度）的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Ct=k×lg（DNA拷貝數(shù)）+b），計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性斜率k值。根據(jù)公式E=10-1/k-1計算定量PCR的擴(kuò)增效率。

1.3.7 實際樣品檢測實驗

用所建立的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR方法和普通TaqMan探針實時熒光PCR方法同時對13 份米制品進(jìn)行檢測，每檢測位點重復(fù)3 次檢測。兩者除了探針引物不同之外，其他其他反應(yīng)體系、DNA用量和反應(yīng)條件完成一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2584—2010《水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR檢測方法》[8]規(guī)定了篩查轉(zhuǎn)基因水稻成分外源基因CaMV35S、NOS和Cry1A的實時熒光PCR檢測方法。本研究以上述3 種基因標(biāo)準(zhǔn)方法檢測目標(biāo)區(qū)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計摻入鎖核苷酸的LNA-TaqMan的短探針和引物。由于摻入鎖核苷酸的數(shù)目和位置直接影響探針的長短和實時熒光PCR反應(yīng)的效果，本研究以100%科豐8號樣品DNA為材料，將這些設(shè)計制備的鎖核酸探針（包括相配套的引物）的實時熒光PCR反應(yīng)在同等條件下與標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2584—2010規(guī)定的實時熒光反應(yīng)進(jìn)行比較，根據(jù)實時熒光PCR反應(yīng)Ct值提前最多（或大）同時鎖核酸探針最短的原則，最終確定了檢測CaMV35S、NOS和Cry1A位點的鎖核酸探針和引物序列（表1）。上述三位點中CaMV35S和NOS的基于鎖核酸探針的實時熒光PCR反應(yīng)在不同DNA濃度時Ct值比相應(yīng)普通探針實時熒光PCR方法均提前1～3個循環(huán)（表2）；位點Cry1A不同濃度檢測Ct值提高沒有規(guī)律，但設(shè)計的探針比普通TaqMan探針大大縮短。以上結(jié)果表明這種基于LNA-TaqMan探針檢測方法的靈敏度有了很大地提高。

2.2 特異性實驗結(jié)果

如表3所示，CaMV35S基因在KF6、Bt11、KF8、KMD1、LLRice6和LLRice601等轉(zhuǎn)基因樣品中實際存在[4,9-13]，而本實驗的特異性檢測結(jié)果與其一致；NOS基因和Cry1A基因也得到了相同的結(jié)果；同時上述3 個基因均沒有在泰國香米、東北大米和其他非轉(zhuǎn)基因植物中檢出。以上結(jié)果表明本研究建立的檢測方法特異性強(qiáng)。

2.3 檢測低限測定結(jié)果

以100%科豐8號樣品DNA通過梯度稀釋獲得的30、3 ng，300、30、3 pg和0.3 pg的總DNA模板量進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，每個DNA樣品重復(fù)3 次。表4顯示，對于300 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來說，3 個篩查基因均得到有效擴(kuò)增，且其Ct值均小于35，且不同重復(fù)間曲線重合性較好（圖1～3）。對于30 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來說，CaMV35S基因只有一個出現(xiàn)擴(kuò)增，且Ct值已超過37（圖1未給出擴(kuò)增曲線），表明其檢測低限低于300 pg；但NOS基因和Cry1A基因兩者均可以檢出，且Ct值在30左右，且重復(fù)性較好（圖2和圖3），可見該兩基因的檢測方法的靈敏度優(yōu)于CaMV35S。對于3 pg和0.3 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來說，NOS基因和Cry1A基因兩者均有擴(kuò)增，NOS基因擴(kuò)增重復(fù)性較好（圖2），Ct值在37左右；Cry1A基因在3 次重復(fù)中只擴(kuò)增出1 次，Ct值已在37左右，可見0.3 pg基因組DNA（100%轉(zhuǎn)基因含量）是兩基因的檢測低限。另外，計算擴(kuò)增效率顯示，CaMV35S、NOS和Cry1A基因的擴(kuò)增效率分別為120%、105%和105%。

2.4 實際樣品的檢測結(jié)果

用建立的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR方法和普通TaqMan探針實時熒光PCR方法同時對13份米制品進(jìn)行檢測，每位點重復(fù)3 次檢測，Ct值取其平均值，檢測結(jié)果見表5。從表5可以看出，13 個米制品中提取的基因組DNA質(zhì)量很好，沒有抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)存在，因為內(nèi)源基因Gos9擴(kuò)增效果好；3 種旺旺米制品和爆米花內(nèi)源基因Gos9擴(kuò)增Ct值高，表明大米制品DNA的降解比另外9 種米粉和米線產(chǎn)品程度大。從2 種方法外源基因的擴(kuò)增Ct值可以看出，2號、3號、東莞、河源、桂林和江西米粉6個樣品2 種實時熒光PCR均有擴(kuò)增信號，其Ct值在33.12～38.89之間，表明它們含轉(zhuǎn)基因成分，但含量低，是典型的弱陽性樣品。旺旺大米餅2 種探針檢測均無擴(kuò)增信號，表明該大米制品不含轉(zhuǎn)基因大米成分。而對于其他6 種大米制品兩種方法檢測的結(jié)論不同，普通TaqMan探針實時熒光PCR檢測結(jié)果為陰性，而本研究建立的方法檢測結(jié)果為陽性，因為CaMV35S基因檢測呈陽性。從表5還可以看出，位點CaMV35S和NOS位點鎖核酸探針實時熒光PCR檢測Ct值比普通實時熒光PCR方法均提前1～3各循環(huán)；對于位點Cry1A，含LNA探針實時熒光PCR反應(yīng)Ct值也均有提前，但對樣品桂林米粉和江西米粉Ct值提前不到1 個循環(huán)（表5中帶“*”的Ct值）?？梢姳拘路椒ǖ臋z測靈敏度優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用的普通探針實時熒光檢測方法。這是因為鎖核酸探針與靶序列DNA結(jié)合穩(wěn)定性高、熒光信號強(qiáng)、嘈音低，熒光信號更易為PCR儀檢出；另外，由于鎖核酸探針比普通探針短很多（表1），對于DNA高度降解的加工食品，其有效模板數(shù)相對增加了。

3 討 論

目前，針對大米制品等加工食品低痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法，主要有TaqMan或SYBR Green實時熒光PCR和巢式PCR等分子檢測方法[9,14-16]，其檢測靈敏度可達(dá)0.01%（質(zhì)量百分比）。但這些PCR方法的檢測目標(biāo)DNA一般在100 bp以上，由于加工食品中DNA遭到高度降解，許多DNA片段小于以上長度，因而進(jìn)一步降低加工食品中PCR反應(yīng)有效的起始模板數(shù)，致使這些方法的實際檢測靈敏度大大降低。而巢式PCR還存在易污染、假陰性等現(xiàn)象。因此，對加工食品高度降解后短片斷DNA的檢測，是提高檢測靈敏度高的關(guān)鍵。

LNAs是核酸的類似物，其與普通寡核苷酸類似物相比在其碳環(huán)的2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，其不但可以與DNA、RNA結(jié)合成雙鏈，且其雙鏈的熱穩(wěn)定性更高。據(jù)研究在普通探針中引入一個LNA堿基可增強(qiáng)探針和底物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高探針Tm（退火溫度）3～8 ℃并使TaqMan探針信號增強(qiáng)、信噪比增大[17-18]。因此，相同長度的含LNA的雜交探針比普通雜交探針與目標(biāo)序列的雜交特異性更高，目前含LNA雜交探針的這一特點已應(yīng)用于如芯片、原位雜交等分子生物學(xué)領(lǐng)域[19]。同理，在相同解鏈溫度條件下，LNATaqMan探針比普通TaqMan探針短。LNA-TaqMan探針可以設(shè)計較得更短的這一特點已應(yīng)用于檢測復(fù)雜目標(biāo)序列，如AT或GC富含區(qū)。Tranh等[20]應(yīng)用LNA-TaqMan探針RT-PCR檢測H5N1流感病毒，并指出LNA探針因其檢測的高效率性而與實時熒光定量PCR結(jié)合用于臨床疾病檢測。韋信賢等[21]應(yīng)用LNA-TaqMan探針熒光定量PCR快速檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，證明該方法檢測IHHNV的靈敏度高，可以檢測到約10 個病毒粒子/反應(yīng)，且特異性、重復(fù)性和重現(xiàn)性較好。

LNA-TaqMan探針比常規(guī)TaqMan探針可設(shè)計得更短，可以適于加工食品中降解DNA的檢測，然而這一特點迄今未用于轉(zhuǎn)基因檢測。本實驗通過比較分析轉(zhuǎn)基因大米常見品系的分子特征，選擇覆蓋面廣的CaMV35S、NOS和Cry1A基因作為篩查基因，并針對這3 個位點設(shè)計了鎖核酸檢測引物和探針，使檢測的目標(biāo)序列比普通實時熒光檢測目標(biāo)區(qū)大大縮短。這些位點的基于LNATaqMan探針的檢測方法特異性強(qiáng)，檢測靈敏度非常高，檢測低限可以達(dá)到0.3 pg，根據(jù)理論推算，一個單倍體水稻基因組的大小為0.47 pg[4]，該方法等同于能檢測到1 個拷貝左右的目的基因。重復(fù)性實驗表明所建立的方法具有較好的穩(wěn)定性，在不同重復(fù)間曲線擬合性較好。在對實際轉(zhuǎn)基因米粉樣品進(jìn)行檢測時，可以快速、準(zhǔn)確地檢測出米制品中的痕量轉(zhuǎn)基因成分。該方法與普通TaqMan探針法相比不僅檢測靈敏度較高、重現(xiàn)性好，而且Ct值明顯提高。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，如實時熒光PCR檢測Ct值大于36，須重新對樣品進(jìn)行檢測。LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測Ct值提前這一特點，利于弱陽性樣品檢測Ct值降到36以下，從而利于結(jié)果的判斷，避免重新檢測樣品，節(jié)約了檢測成本。

本研究應(yīng)用LNA-TaqMan探針解決了米制品等食品中含位點CaMV35S、NOS和Cry1A痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測難題。其他轉(zhuǎn)基因篩查位點的檢測同樣可以采用LNATaqMan探針，來建立超靈敏和高特異性檢測方法。轉(zhuǎn)基因品系檢測比轉(zhuǎn)基因篩查更能區(qū)分產(chǎn)品中批準(zhǔn)和未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分，今后采用本研究方法研究建立以轉(zhuǎn)基因品系邊界序列為目標(biāo)的基于LNA-TaqMan探針的實時熒光PCR檢測方法意義更為重要。

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Ultra-Sensitive Detection of Genetically Modified Ingredients in Rice-Derived Products Using Real-Time PCR with Locked Nucleic Acid TaqMan Probe

PAN Guang1, ZHANG Guiming1, CHEN Zhinan2, CHENG Yinghui1, XIANG Caiyu1, BAO Xianyu2, LING Xingyuan1,*
(1. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 2. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518010, China)

This study aimed to establish a specific and ultra-sensitive detection method for trace genetically modified (GMO) ingredients in rice-derived products. In this study, the CaMV35S promoter, NOS terminator and Cry1A gene included in the industrial standard for screening the GM components of rice were selected as the targets. By substituting a few nucleotides of the TaqMan probe with locked nucleic acid (LNA) nucleotide and comparing the performances of these LNA-TaqMan probes in real-time PCR (RT-qPCR), a novel real-time PCR method based on LNA-TaqMan probe for the above genes and gene elements was established with high specificity. Compared to the conventional RT-PCR with TaqMan probe, this RTPCR with LAN-Taqman probe was much more sensitive, ha d lower limit of detection (LOD) (0.001% by mass) and 1-3 less Ct value cycles except for Cry1A. This reported new PCR method can be applied for the detection of trace GM components in rice-derived products that could not be detected with the conventional RT-PCR probe.

rice-de rived products; locked nucleic acid (LNA); LNA-TaqMan probe; real-time PCR

S511

A

10.7506/spkx1002-6630-201510042

2014-07-24

深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計劃重點項目(JC201105190969A)；國家轉(zhuǎn)基因重大專項 (2014ZX08012-001)

潘廣(1985—),男,農(nóng)藝師,碩士,研究方向為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。E-mail：pg0101@126.com

*通信作者：凌杏園(1964—),男,高級農(nóng)藝師,博士,研究方向為植物基因工程和分子生物學(xué)。E-mail：lxy6421@qq.com