徐 偉, 蔣民軍,徐 辰,宋日進(jìn), 王曉嵐, 張 煒

(1.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院急診外科, 江蘇蘇州 215200;2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院泌尿外科, 江蘇蘇州 215200;3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科, 江蘇南京 210029)

·基礎(chǔ)研究·

Klotho基因(rs3752472)與草酸鈣結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的多態(tài)性研究

徐 偉1, 蔣民軍2,徐 辰2,宋日進(jìn)3, 王曉嵐3, 張 煒3

(1.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院急診外科, 江蘇蘇州 215200;2蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院泌尿外科, 江蘇蘇州 215200;3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科, 江蘇南京 210029)

目的 探討華東地區(qū)漢族人群中Klotho基因多態(tài)性與尿路草酸鈣結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。方法 納入1 704名尿路草酸鈣結(jié)石患者及1 128名健康對(duì)照者，通過(guò)TaqMan單核苷多態(tài)性基因型分析方法，對(duì)3個(gè)Klotho基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs3752472、rs650439和rs577912)與尿路草酸鈣結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)人群中Klotho基因rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)CC純合子基因型攜帶者尿路草酸鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)幾乎兩倍于CT雜合子基因型攜帶者及TT純合子基因型攜帶者(95%CI=1.013～2.255,OR=1.512,P=0.043)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)人群中Klotho基因rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)與尿路草酸鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，可能作為風(fēng)險(xiǎn)因子在結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用。

Klotho;氧化應(yīng)激損傷;泌尿系結(jié)石;單核苷多態(tài)性

尿路結(jié)石作為泌尿系統(tǒng)常見疾病，由基因及環(huán)境因素共同作用形成[1]。研究證實(shí)草酸鈣結(jié)石是尿路結(jié)石最常見的組成成分，其可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷作用破壞腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)[2-3]。DAVALOS等[4]研究發(fā)現(xiàn)一水草酸鈣通過(guò)氧化應(yīng)激損傷對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，從而降低細(xì)胞活力，最終促成了尿路結(jié)石的形成。

Klotho蛋白最初是作為抗衰老蛋白被人類所熟識(shí)[5]。Klotho表達(dá)產(chǎn)物有兩種，除了膜型Klotho蛋白，分泌型Klotho蛋白以游離形式存在于人體的尿液，血液及腦脊液中[6]。研究證實(shí)分泌型Klotho蛋白不僅可以作為調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝的節(jié)拍器，還在抑制胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like Growth Factors -1,IGF-1)信號(hào)通路及氧化應(yīng)激損傷方面具有重要的作用[2,7]。

綜上所述，氧化應(yīng)激損傷與尿路草酸鈣結(jié)石的形成關(guān)系密切，而研究證實(shí)Klotho蛋白存在抗氧化作用，這三者之間是否存在著某種尚未發(fā)現(xiàn)的聯(lián)系我們不得而知。因此，本研究將針對(duì)3個(gè)Klotho基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs3752472, rs650439, rs577912)，探討其在華東地區(qū)漢族人群中與尿路草酸鈣結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 一般資料共有1 704例草酸鈣或含草酸鈣結(jié)石的尿石癥患者(男1 196例，女408例，平均年齡(47.7±12.0)歲被納入本次研究，均為華東地區(qū)漢族人群。所有結(jié)石樣本均來(lái)自于體外沖擊波碎石后患者自行排出或經(jīng)外科手術(shù)取出，且通過(guò)紅外光譜分析技術(shù)進(jìn)行結(jié)石成分測(cè)定，確定為單一草酸鈣結(jié)石或含草酸鈣結(jié)石者則納入本次研究。設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。本研究對(duì)照組由1 128例華東地區(qū)無(wú)尿路結(jié)石病史的健康漢族志愿者(男848例，女280例)，平均年齡(48.4±13.0)歲組成。

兩組人群入組前均已簽訂知情同意書，并通過(guò)了南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 研究方法收集試驗(yàn)組及對(duì)照組所有研究對(duì)象的血液及尿液樣本進(jìn)行分析，包括存在高鈣血癥、高草酸血癥、腫瘤或甲狀旁腺功能亢進(jìn)等可能影響人體鈣或草酸代謝的因素的研究人群均排除于此項(xiàng)研究。本次研究?jī)H分析比較兩組人群24 h尿鈣、尿磷、血鈣、血磷、血肌酐及血乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平變化。

將兩組人群外周靜脈血編號(hào)，均取10 mL，EDTA抗凝，-80°C保存?zhèn)溆谩＠萌蚪MDNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA?；蛐头治霾捎肨aqMan探針法進(jìn)行，各個(gè)SNP的探針及引物的序列均符合本次試驗(yàn)要求。利用ABI 7900HT 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用SDS2.4軟件對(duì)各個(gè)等位基因差異進(jìn)行基因分型。對(duì)不能確定基因分型進(jìn)行兩次或多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。隨機(jī)選取8%～10%(本次為10%) 的樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均與首次分型結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素ANOVA檢驗(yàn)對(duì)Klotho基因型定量變量進(jìn)行分析。計(jì)算各群體基因型及等位基因頻率，群體間基因型及等位基因頻率差別以及結(jié)石形成風(fēng)險(xiǎn)因子與Klotho基因多態(tài)性之間存在的聯(lián)系用二元Logistic回歸進(jìn)行分析。OR值的可信區(qū)間為95%。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)水準(zhǔn)定義為α<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組人群血鈣含量及24 h尿鈣濃度明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039；P<0.000 1，表1)。然而兩組間在血LDH濃度及尿pH并沒有明顯的區(qū)別(P=0.124；P=0.400)。試驗(yàn)組人群血磷水平明顯低于對(duì)照組人群，且擁有更差的腎功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1；P=0.027)。

表1 本研究納入人群資料(n=2 832)

兩組比較，*P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

Klotho基因型頻率在結(jié)石組和對(duì)照組均符合Hardy- Weinberg平衡定律(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組中rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)C等位基因頻率為0.924而T等位基因頻率為0.076，而在對(duì)照組中，C與T等位基因頻率分別為0.894及0.106； rs577912多態(tài)性位點(diǎn)(A/C)等位基因頻率在實(shí)驗(yàn)組中為0.250/0.750，而在對(duì)照組中為0.215/0.785；而rs650439多態(tài)性位點(diǎn)A與T等位基因頻率在實(shí)驗(yàn)組(0.688/0.312)與對(duì)照組(0.676/0.324)的比較中，亦未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，在對(duì)三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分析比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)僅rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)與尿路草酸鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。與CC純合子基因型攜帶者相比，TT純合子基因型及CT雜合子基因型攜帶者發(fā)生尿路草酸鈣結(jié)石的OR值為1.512 (95%CI=1.013～2.255,P=0.043,表2)。

表2 Klotho基因多態(tài)性基因型與等位基因頻率及與泌尿系結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性(例)

OR(odd ratio 比值比);CI(confidenceinterval 可信區(qū)間)。1:參考系 基因型/等位基因;2:CC純合子基因型與CT +TT基因型進(jìn)行分析比較;3:AA純合子基因型與AT +TT基因型進(jìn)行分析比較;4:CC純合子基因型與AC +AA基因型進(jìn)行分析比較;試驗(yàn)組與對(duì)照組比較時(shí)*P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

為了探索不同Klotho基因型與尿路草酸鈣結(jié)石發(fā)病危險(xiǎn)因子之間潛在的聯(lián)系，我們分別分析比較了兩組人群的血磷與血鈣水平、24 h尿磷與尿鈣水平、血肌酐、血乳酸脫氫酶水平以及尿pH(表3)。實(shí)驗(yàn)組中rs577912多態(tài)性位點(diǎn)A等位基因攜帶者結(jié)石患者血鈣水平明顯低于CC純合子基因型攜帶者，而這一差異在對(duì)照組人群中并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036))。然而，在對(duì)照組中，rs577912多態(tài)性位點(diǎn)A等位基因攜帶者血肌酐水平明顯高于CC純合子基因型攜帶者，該差異在試驗(yàn)組中卻未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.031)。比較 rs3752472 與 rs650439多態(tài)性位點(diǎn)試驗(yàn)組與對(duì)照組人群血鈣水平，均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

作為發(fā)展中國(guó)家最常見的泌尿系疾病之一，尿路結(jié)石長(zhǎng)久以來(lái)一直困擾著人們。尿路結(jié)石成分分析結(jié)果顯示草酸鈣是尿路結(jié)石中最常見的結(jié)石成分[2]。研究發(fā)現(xiàn)高濃度草酸或草酸鹽結(jié)晶在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)聚集可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，從而破壞細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)[8]。

表3 Klotho基因不同基因型在試驗(yàn)組與對(duì)照組中關(guān)于結(jié)石相關(guān)臨床癥狀的分析比較

組 別Rs3752472CCCT+TTP值Rs650439AAAT+TTP值Rs577912CCAC+AAP值實(shí)驗(yàn)組性別(男性/女性)1024/440172/680.787632/180564/3280.753692/284504/2240.709年齡(歲)47.8±12.447.3±12.00.77448.4±12.647.1±12.00.27146.9±12.548.8±12.00.127血鈣(mg/dL)9.2±0.49.2±0.40.5389.2±0.89.2±0.40.7629.2±0.49.1±0.40.036*血磷(mg/dL)3.4±1.83.4±0.60.6413.4±0.63.4±0.60.3023.4±0.63.4±0.60.44024h尿鈣(mg)239.1±145.7247.1±144.60.721226.3±141.5252.7±148.00.090238.5±148.7242.4±141.30.80024h尿磷(mg)349.5±244.2395.6±218.70.214351.7±255.5359.7±227.90.757362.4±253.6347.3±224.00.561血肌酐(μmol/L)91.2±32.493.4±29.20.80596.5±40.187.8±23.60.18192.1±32.590.7±31.20.828尿pH6.0±0.66.1±0.60.7416.0±0.76.1±0.60.3966.0±0.66.1±0.60.681乳酸脫氫酶(U/L)162.1±31.6 164.3±20.6 0.804157.6±28.6 166.0±31.3 0.176162.4±30.9 162.6±29.9 0.976組別Rs3752472CCCT+TTP值Rs650439AAAT+TTP值Rs577912CCAC+AAP值對(duì)照組性別(男性/女性)676/228172/520.756404/104444/1760.127504/200344/800.074年齡(歲)48.7±13.047.1±15.30.44247.9±12.648.9±14.10.56849.1±13.747.2±13.00.264血鈣(mg/dL)9.2±0.49.2±0.40.3449.2±0.49.2±0.40.0769.2±0.49.2±0.40.439血磷(mg/dL)3.7±0.63.7±0.60.4363.7±0.63.7±0.60.5153.7±0.63.7±0.60.45024h尿鈣(mg)105.4±81.4 119.0±88.7 0.80887.4±79.9135.7±82.3 0.34776.6±61.6159.5±83.8 0.06324h尿磷(mg)268.3±90.2 364.7±240.80.288255.9±109.5305.9±144.80.553271.8±101.3320.6±181.30.542血肌酐(μmol/L)81.3±25.586.5±21.90.47981.0±14.583.5±30.70.66378.0±14.191.3±37.20.031*尿pH5.9±0.26.2±0.80.1845.9±0.66.0±0.70.5045.9±0.76.2±0.60.189乳酸脫氫酶(U/L)190.0±134.5184.0±60.90.867184.8±133.4191.9±115.20.808184.1±112.5198.4±143.40.642

依據(jù)基因型比較臨床癥狀時(shí)，*P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)分泌型Klotho蛋白過(guò)表達(dá)可對(duì)抗氧化應(yīng)激作用，對(duì)心血管-腎臟系統(tǒng)提供保護(hù)，使機(jī)體組織免受氧化應(yīng)激損傷，最終達(dá)到延緩機(jī)體衰老過(guò)程的作用[9]。OHTA[10]等完成了大鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)Klotho基因可上調(diào)大鼠模型體內(nèi)錳超氧化物歧化酶的表達(dá)，從而達(dá)到抑制氧化應(yīng)激損傷的進(jìn)程。綜上所述，我們猜測(cè)Klotho基因可能擁有對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的作用。已有多項(xiàng)研究證實(shí)rs3752472，rs650439和 rs577912三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與氧化應(yīng)激損傷作用息息相關(guān)[11-12]，而氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致泌尿系結(jié)石的形成，因此，本次研究選擇rs3752472，rs650439和 rs577912三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別探討其與尿路草酸鈣結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

我們的研究結(jié)果顯示rs3752472的CC純合子基因型攜帶者發(fā)生尿路草酸鈣結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于T等位基因攜帶者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.043)。然而，研究并未發(fā)現(xiàn)兩組人群中rs3752472等位基因頻率與尿路草酸鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.087)。本研究Klotho基因多態(tài)性位點(diǎn)rs650439與rs577912等位基因及基因型在兩組人群間比較均無(wú)顯著差異(P=0.494；P=0.174)。2011年，TELCI等[13]首次報(bào)道了土耳其人群中Klotho基因多態(tài)性位點(diǎn)G395A與尿路結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)GG基因型攜帶者結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)幾乎兩倍于A等位基因攜帶者。研究同時(shí)證實(shí)不攜帶A等位基因的人群更易出現(xiàn)結(jié)石相關(guān)的臨床癥狀，如高鈣血癥，低磷血癥和高磷酸鹽尿。

已有多項(xiàng)研究證實(shí)Klotho基因參與介導(dǎo)機(jī)體鈣磷代謝，然而本次研究對(duì)于結(jié)石相關(guān)的臨床癥狀的比較中我們僅在rs577912多態(tài)性位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)血鈣水平的變化具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在比較rs3752472及rs650439多態(tài)性性位點(diǎn)與結(jié)石相關(guān)臨床癥狀時(shí)，我們并未發(fā)現(xiàn)任何有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)。究其原因可能與研究人群的飲食習(xí)慣以及服用藥物等實(shí)驗(yàn)本身難以控制的干擾因素有關(guān)。

雖然rs3752472CC純合子基因型攜帶者易發(fā)生尿路草酸鈣結(jié)石病的原因仍未知，但根據(jù)我們的研究結(jié)果，我們推測(cè)該變異可能源于Klotho蛋白表達(dá)水平的變化。當(dāng)與核內(nèi)蛋白提取物結(jié)合時(shí)，rs3752472的T等位基因寡核苷酸可能較C等位基因寡核苷酸形成一個(gè)活性更高的DNA-蛋白復(fù)合體，從而導(dǎo)致氨基酸突變后的Klotho蛋白表達(dá)下降[14]。最終，CC純合子基因型攜帶者體內(nèi)Klotho蛋白表達(dá)水平降低，低于T等位基因攜帶者。分泌型Klotho蛋白表達(dá)水平下降激活了胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子-1信號(hào)通路，致使FOXO轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O, FOXO)表達(dá)水平下降，從而機(jī)體體內(nèi)抗氧化應(yīng)激損傷作用的輔酶表達(dá)水平下降，對(duì)機(jī)體有害的活性氧簇產(chǎn)生過(guò)多，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)因氧化應(yīng)激作用遭受破壞，促進(jìn)結(jié)石形成。據(jù)此，我們猜測(cè)CC純合子基因型攜帶者較T等位基因攜帶者應(yīng)具有更高的LDH水平，然而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的LDH水平相近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)CC純合子基因型攜帶者與尿路草酸鈣結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。然而，本次研究樣本量較小，仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究來(lái)驗(yàn)證Klotho基因rs3752472多態(tài)性位點(diǎn)在尿路草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中的潛在功能。

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(編輯 王 瑋)

Klotho gene polymorphism of rs3752472 is associated with the risk of calcium oxalate calculi

XU Wei1, JIANG Min-jun2, XU Chen2, SONG Ri-jin3, WANG Xiao-lan3, ZHANG Wei3

(1.Department of Emergency the First People’s Hospital of Wujiang City, Wujian 215200; 2. Department of Urology, the First People’s Hospital of Wujiang City, Wujian 215200; 3. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Objective To investigate the possible relationship between klotho gene polymorphism and the risk of calcium oxalate urolithiasis in Han nationality in Eastern China. Methods Klotho gene polymorphism rs3752472, rs650439 and rs577912 were investigated in 1 704 patients with calcium oxalate stones and 1 128 age-matched healthy volunteers with no history of stone formation, usingTaqMan SNP Genotyping Assays. Results Significant differences were found between rs3752472 and the risk of nephrolithiasis as CC genotype of rs3752472 klotho polymorphism had almost 2-fold increased stone risk compared with the heterozygote genotype CT and homozygous genotype TT (95%CI=1.013-2.255,OR=1.512,P=0.043). Conclusions Our results showed that the rs3752472 polymorphism of klotho gene is associated with the risk of calcium oxalate urolithiasis and may act as a risk factor during stone formation in Han population.

klotho; oxidative stress; urolithiasis; polymorphism

2014-10-08

2014-11-03

徐偉(1982-)，男(漢族)，住院醫(yī)師.E-mail：463161688@qq.com;蔣民軍(1970-)，男(漢族)，主任醫(yī)師.E-mail：13606258811@139.com,系共同第一作者。

R692.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-02-016