食源性致病菌菌膜形成影響因素研究進展

吳 嫚，李 森，吳淑燕，陳國薇，劉 芳，張 超，董慶利，劉 箐,*

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅蘭州730020）

食源性致病菌菌膜形成影響因素研究進展

吳 嫚1，李 森1，吳淑燕1，陳國薇1，劉 芳2，張 超1，董慶利1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅蘭州730020）

菌膜是微生物黏附在介質表面形成的大量細菌群居的一種生存狀態(tài)，結構致密的菌膜能夠使細菌更強地抵御外界的不利環(huán)境而生存下來。在食品工業(yè)中，菌膜的形成使污染的細菌難以被徹底清除；而在醫(yī)學領域，由于菌膜對抗生素的耐藥性使其成為許多慢性感染性疾病反復發(fā)作和難以控制的主要原因之一。本文綜合分析了近年來菌膜形成影響因素的研究成果，并對其研究進展及未來發(fā)展予以評述。

食源性致病菌；菌膜；影響因素；食品工業(yè)

由食源性疾病引發(fā)的食品問題已成為我國目前首要的食品安全問題。2010年7月至2011年7月間，國家食品安全風險評估中心監(jiān)測了上海等六省急性胃腸炎的發(fā)生，結果顯示，我國急性胃腸炎的發(fā)病率為0.56 次/（人·a），其中由食源性疾病引發(fā)的發(fā)病率為0.157 次/（人·a），平均每6 個人即有1 人發(fā)生食源性疾病[1]。在世界范圍內(nèi)，目前全球每年因食源性疾病而發(fā)病的人數(shù)約10億 人，美國每年約有4 800萬 人患病，12.8萬 人入院接受治療[2]。以上這些數(shù)字足以說明食源性疾病已成為嚴重影響人類健康的常見病。

食源性疾病的致病因子主要有：病毒、細菌、寄生蟲、生物毒素和化學物質等，其中，微生物是主要食源性疾病病原。從2006—2010年4 年間，衛(wèi)生部公布的食物中毒事件中，微生物引起的食物中毒事件占40.09%，患者人數(shù)占61.92%，居食品安全事件首位，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙門氏菌（Salmonella）、變形桿菌（Proteus vulgaris）和致泄性大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是主要的致病細菌[3]。這些菌膜菌在形成菌膜后，對各種化學殺菌劑的敏感程度只有浮游菌的1/10～1/1 000，耐熱性也相應增加，并且對環(huán)境變化不敏感，使感染部位難以得到徹底清除。在食品的加工、運輸和貯藏的過程中，致病菌以菌膜形式黏附在固體上使細菌難以清除，導致致病菌的擴散蔓延，是造成食源性致病菌污染的一個重要原因。

菌膜（biofilm，BF）是細菌在生長過程中為了適應生存環(huán)境而吸附于惰性物體后形成的一種特殊的復合體，由細菌和自身分泌的多糖、蛋白質等胞外基質組成，是一個三維立體空間結構的生態(tài)系[4]。在菌膜的保護下，細菌可以在紫外線、有毒金屬、酸、鹽和抗菌劑等多種惡劣的條件下生存，并且還能忍受高濃度的消毒劑和食品防腐劑。在研究中發(fā)現(xiàn)，影響菌膜黏附和形成的主要因素包括與細菌接觸面的物理化學性質（靜電電荷和疏水性）、細菌血清型的多樣性、細菌鞭毛的表達、胞外聚合物的組成以及環(huán)境條件如pH值、溫度和培養(yǎng)基等[5]。本文將一一對這些因素如何影響菌膜形成展開詳細介紹。

1　黏附材料對菌膜形成的影響

菌膜黏附的材質的物理化學性質主要是指其靜電荷數(shù)和疏水性，不同的材質對細菌菌膜的形成十分重要，會影響菌膜的初始黏附能力，繼而導致最終菌膜形成量的差異。

Kennedy等[6]研究了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分別在處理過的組織培養(yǎng)板和未處理的聚苯乙烯培養(yǎng)板上的生長情況，并對菌膜的生成量進行比較，結果發(fā)現(xiàn)在處理過的組織培養(yǎng)板上，金黃色葡萄球菌菌膜的形成量會增加很多，未處理的培養(yǎng)板是疏水性的，而經(jīng)過處理后的培養(yǎng)板具有親水性并帶有負電荷，其原因也許是這種親水性材料會促進細菌細胞的黏附。在實驗室中，測定菌膜最常用的方法之一是96 孔細胞培養(yǎng)板，其材料是疏水性的聚苯乙烯，李瓊瓊等[7]發(fā)現(xiàn)，通過對聚苯乙烯材料表面進行羊血漿處理或者商品化組織（真空血漿噴霧）處理，使其表面的疏水性降低，可使金黃色葡萄球菌菌膜的生成量顯著提高。Nguyen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhiumukriunm）比較偏愛不銹鋼，而不太適合黏附到有機玻璃表面。Ryu等[9]則發(fā)現(xiàn)不銹鋼是適度親水的，并且表面帶負電荷，而聚苯乙烯卻是疏水性的。

不銹鋼是食品加工最常用的材料，而在食品加工、運輸和貯藏的過程中，一旦不銹鋼材質的表面不小心被污染了食源性致病菌，等其形成菌膜，就很難徹底地清理干凈。因此，食品加工廠在選擇食品包裝及運輸材料時應避免選擇不銹鋼等親水性材料，而應多考慮聚苯乙烯及有機玻璃等疏水性材料，或者降低材料表面的親水性，這樣，即使被污染了病原菌，菌膜的形成量很少或生長緩慢處于未成熟階段便于清理，既保證了食品的安全性，又使廠家避免遭受難以估計的損失。

2　生存環(huán)境對菌膜形成的影響

菌膜的形成受細菌細胞間的群體感應調節(jié)的影響，與外部環(huán)境的刺激緊密相關，因此，在不同的環(huán)境條件下，細菌菌膜的形成方式及其累積量會有所不同[10]。關于環(huán)境條件，本文主要介紹溫度、pH值以及培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對菌膜形成的影響。

2.1溫度

在食品加工、運輸和貯藏的過程中所涉及的溫度范圍較廣泛，因此，關于溫度對菌膜形成影響的研究很有意義。溫度是影響菌膜形成的重要因素，在不同的培養(yǎng)溫度下，菌膜的形成量表現(xiàn)出較大的變化。李瓊瓊等[7]研究了10 株不同來源的金黃色葡萄球菌在不同溫度下菌膜的生成量，發(fā)現(xiàn)其中3 株在37 ℃時菌膜形成量最大，4 株在42 ℃時菌膜量達到最大，3 株在46 ℃達到最大，1 株菌膜的生成量一直較低，但溫度的升高也能刺激菌膜的形成。di Bonaventura等[11]研究4、12、22、37 ℃溫度下單增李斯特菌在聚苯乙烯、玻璃、鋼材料表面形成菌膜能力時發(fā)現(xiàn)，不管是在哪種材料表面，4 ℃時菌膜生成的量最少。

由此可知，較高的溫度有利于菌膜的形成，所以，當環(huán)境溫度較高時，食品加工廠應當預防細菌生成菌膜而帶來的安全隱患?，F(xiàn)在大多數(shù)低溫貯存食品都選擇4 ℃，雖然4 ℃也能形成菌膜，但是相對來說該溫度形成的菌膜量較少，而且大多數(shù)致病菌在4 ℃條件下生長速率緩慢，所以食品加工廠要盡可能的在低溫條件下作加工、運輸和貯藏食品。

2.2pH 值

細菌生長環(huán)境pH值的不同往往會影響其生長速率和生長量，每種菌都有適于自己生長的pH值條件，一旦過酸或過堿則會給其形成一種不利環(huán)境的壓迫，細菌為了保護自己則會形成更多的菌膜，因此，找到一個可以把細菌菌膜生長量降到最低的一個pH值是至關重要的。

Nguyen等[8]通過比較在pH值為6和7的酸性條件下鼠傷寒沙門氏菌菌膜形成量發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)后的前十幾小時之內(nèi)，pH 6的條件下菌膜形成量要比pH 7條件下的形成量要少，因此，猜測培養(yǎng)基的酸度主要影響細菌的初始附著的能力，導致其在較低的pH值條件下菌膜形成能力下降。Tresse等[12]的研究也有類似的結果，他們發(fā)現(xiàn)4 種單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）株在pH 5條件下黏附聚合物表面的能力比pH值為7時的要差，表明食品保存的條件可能對單增李斯特菌的黏附能力有一定的影響。因此，在食品加工過程中，能夠利用低pH值這一有利條件來延誤細菌菌膜在惰性表面的形成，將會減少食源性致病菌給人帶來的危害。

2.3培養(yǎng)基營養(yǎng)成分

盡管不同的細菌對營養(yǎng)的需求不同，但培養(yǎng)基中應包含其所需要的營養(yǎng)物質：碳源、氮源、無機鹽和生長因子等。經(jīng)前人的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的糖類和無機鹽類會對細菌菌膜的生成量產(chǎn)生一定的影響。

Lim等[13]對金黃色葡萄球菌進行高鹽滲透發(fā)現(xiàn)，NaCl的質量分數(shù)低于1.6%時，菌膜的形成量按比例升高；在1.6%～5.6%之間時，菌膜生成量達到穩(wěn)定；而高于5.6%時，則沒有發(fā)現(xiàn)有菌膜生成。而李瓊瓊等[7]的發(fā)現(xiàn)卻與上述結果有些不同，他們對10 株不同的金黃色葡萄球菌進行研究，在TSB培養(yǎng)基中添加1.0%的NaCl能極顯著提高4 株菌菌膜的形成能力，1 株菌株的菌膜形成量下降，而另外5 株菌菌膜的生成量卻沒什么明顯變化，這可能是因為不同的菌株可能涉及不同的菌膜調控模式。盡管不同質量分數(shù)的NaCl對不同菌株的影響并沒有穩(wěn)定的結果，但足以證明，不管是高鹽還是低鹽，一旦促使細菌感到其處于危險或營養(yǎng)貧乏的地步時，細菌就會產(chǎn)生比平常多的菌膜用來抵御這不利的外界環(huán)境。食品加工廠可以利用這一點，對相應的食品采取一定的處理措施。

利用生存條件對菌膜形成的影響，在食品工業(yè)中可以針對不同特點的食品而使用不同的環(huán)境條件來抑制菌膜的形成。某些不會因溫度改變而改變性質的食品則可以借助高溫來抑制菌膜；而一些食品本身就是酸性物質，則可借助這一點利用pH值來抑制菌膜；有些腌漬食品，則可以利用NaCl來抑制菌膜。

3　抗生素對菌膜形成的影響

由于抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性日趨嚴重，因此，研究細菌菌膜的耐藥機制以及發(fā)現(xiàn)新的抗生素已經(jīng)非常緊迫。

有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的耐藥機制非常復雜，其中菌膜的形成是產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一，使菌對抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強的抵抗力，從而會導致嚴重的臨床問題[14]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對銅綠假單胞菌沒有抑菌活性，有報道稱大環(huán)內(nèi)酯類藥物可抑制或損壞多糖蛋白復合物的產(chǎn)生從而增強其他抗生素的殺菌能力[15-16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用羅紅霉素能增加銅綠假單胞菌菌膜對頭孢噻肟抗生素的敏感性，而單獨使用頭孢噻肟的結果卻沒有聯(lián)合用藥組的作用好[17]。在針對銅綠假單胞菌菌膜則可以使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物作為輔助抗生素，而對于其他致病菌菌膜的研究則可以借助此方法繼續(xù)研究其耐藥機制，此領域也是近年細菌耐藥機制研究的新方向。

4　細菌內(nèi)部基因調控機制和群體感應系統(tǒng)控制菌膜的形成

菌膜的形成過程一般分為兩個階段：黏附階段和聚集階段。在黏附階段主要是細菌與接觸材料間通過物理因素和黏附因子的作用，發(fā)生特異性的結合。緊接著進入聚集階段，在細胞間多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）等的介導下，細菌之間開始相互黏附，繼而分化、增殖，形成細胞團塊，產(chǎn)生大量的黏液，最后形成了菌膜。

胞間多糖黏附素是細菌菌膜形成過程中必不可少的成分，由ica（intercellular adhesion operon）操縱子控制合成。Chien[18]和Cramton[19]等已發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌中ica操縱子的表達受到SarA基因表達的SarA蛋白（一種DNA 結合蛋白）的調控。Valle等[20]通過實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）也發(fā)現(xiàn)，SarA基因的突變，會致ica操縱子轉錄的下調，由此認為SarA能夠通過提高ica操縱子的轉錄而促進金黃色葡萄球菌菌膜的形成。Allignet[21]、Conlon[22]等則發(fā)現(xiàn)ica操縱子中icaADBC結構基因的表達直接控制PIA的合成，PIA可引起細胞間的黏附，在其他因子的參與下可在接觸材料表面形成多層細胞聚集物，無氧條件下可以導致金黃色葡萄球菌ica操縱子的轉錄和PIA合成的增加，因此，在內(nèi)部環(huán)境中，PIA的表達是控制葡萄球菌感染人體的關鍵點之一。

群體感應就是細菌能夠自發(fā)產(chǎn)生、釋放某些特定的信號分子，并且能夠感知其濃度變化，調節(jié)微生物群體行為的調控系統(tǒng)。該系統(tǒng)在菌膜形成過程中主要作用于聚集階段，細菌在感受到外界不利條件的脅迫后，會通過群體感應系統(tǒng)發(fā)出信號，然后細菌開始聚集，并形成菌膜。人們徹底研究的群體感應系統(tǒng)主要包括革蘭氏陰性菌體內(nèi)的酰基高絲酰胺內(nèi)酯（acyl-homoserine lactones，AHL）系統(tǒng)和革蘭氏陽性菌體內(nèi)的小分子多肽作為信號分子[23-25]。還有一類AI-2型系統(tǒng)在革蘭氏陽性菌和陰性菌中均被發(fā)現(xiàn)[23]。Hentzer等[26]發(fā)現(xiàn)，鹵代呋喃酮化合物可以干擾AHL系統(tǒng)，并且通過使用綠色熒光蛋白得出結論：在大多數(shù)菌膜細胞中，呋喃酮化合物可以穿透小菌落，阻礙細胞信號和群體感應系統(tǒng)，進而影響生物膜的結構，并增強細菌互相分離的能力。鹵代呋喃酮與細菌分泌的自誘導物在結構上相似，故而可以與自誘導物競爭性結合到菌體內(nèi)或胞膜上的自誘導物受體，并通過影響細菌的密度感應系統(tǒng)而影響菌膜的形成[27]。

5　其他物質對菌膜形成的影響

在研究菌膜的過程中，往往會發(fā)現(xiàn)一些特殊物質可以影響菌膜的形成，這些物質不是專門抑菌的抗生素，而是一些精油、消毒劑亦或者是一些中藥提取物。這些物質的發(fā)現(xiàn)，既可以減輕細菌對抗生素的耐藥性，也可以在食品加工方面提供更好的細菌清除劑。

Szczepanski等[28]發(fā)現(xiàn)，使用低于精油最小抑菌濃度的量就可以抑制細菌菌膜的形成，而且低濃度的精油還可以抑制使特定食品變質的細菌的活性。而Jadhav等[29]則發(fā)現(xiàn)蓍草精油可以抑制李斯特菌細胞黏附材料表面的初始附著力。Taweechaisupapong等[30]則認為精油這些疏水性化合物有抗菌活性，主要是因為它能破壞細菌的細胞膜，然后導致過度的細胞滲透性。因此，精油或者其成分，可能是發(fā)展新消毒劑有用的添加劑，這些消毒劑則可以應用到食品工業(yè)中。

Elexson等[31]研究了消毒劑對耐抗生素的副溶血性弧菌菌膜的影響，發(fā)現(xiàn)普通的洗滌劑對該菌株有抗菌活性，只是消毒劑的類型、濃度、曝光時間、菌膜的生長時間以及機械損傷這些因素都在影響消毒劑對菌膜的清除能力。Borges等[32]則研究了異硫氰酸酯對菌膜的影響，異硫氰酸酯對菌膜有一定的預防作用，并且有很大的潛能能夠減少大多數(shù)革蘭氏陰性菌的菌膜，因此，異硫氰酸酯可以作為應急產(chǎn)品去抑制細菌的活動性，并且可以抑制重要的人類病原菌的菌膜形成。對細菌過多的使用消毒劑和抗生素，均會使其產(chǎn)生一定的耐藥性，從而降低細菌對這些藥物的敏感性，張文艷[33]在消毒劑中添加了檸檬醛、肉桂醛和茶多酚3 種天然物質，結果發(fā)現(xiàn)，混合菌菌膜對消毒劑雙氧水的抵抗能力降低了2～10 倍，對次氯酸鈉的抵抗力降低了約2～4 倍，而對過氧乙酸的抵抗力則降低了4～8 倍，說明這3 種天然物質可以有效增強混合菌菌膜對消毒劑的敏感性。

在臨床上為了降低細菌的耐藥性，新型消毒劑的研發(fā)是必不可少的，以上的研究將為新的高效的消毒劑或清除劑的開發(fā)作出貢獻。

6　結語

日常生活中，常見的食源性致病菌主要包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni enteritis）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血性弧菌、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）和志賀氏菌（Shigella）等，假若被污染的食品沒有加熱充分，人食入后則極易產(chǎn)生疾病，小到嘔吐腹瀉，重則引發(fā)炎癥，嚴重脫水，甚至有些則會導致死亡，如若引起交叉污染，造成人與人之間的傳播，則后果不堪設想。菌膜的形成嚴重阻礙了致病菌的清除，它就像是細菌的保護傘，增強了細菌對外界不利條件的抵抗力，所以如何避免菌膜形成，徹底清除致病菌成為醫(yī)學和食品工業(yè)中的一大難題。

菌膜的形成是一個遞進的過程：先是細菌依靠自身表面蛋白與接觸表面發(fā)生瞬時黏附，繼而在黏附基質等的作用下聚集在接觸面形成微菌落[34]；緊接著微菌落中的細菌開始進行大量增殖，通過分泌多糖細胞間黏附素等胞外多聚物來形成成熟的菌膜結構[21]。成熟后的菌膜一般都會向環(huán)境中散播細菌，在營養(yǎng)貧乏或其他壓力下，菌膜結構會發(fā)生解離，有部分菌體會從菌群中脫離并向外散播，然后開始新的菌膜形成過程[35]。初始階段細胞黏附可分為可逆黏附和不可逆黏附階段，在可逆黏附階段細胞的附著力較弱，此階段的菌膜比較容易沖洗除去；而在不可逆階段時，則需要較強的作用力（如擦洗、打碎等）才能除去菌膜[36-37]；在形成微菌落階段時，細菌對殺菌劑、抗生素和紫外線等的抗性均有提高[38]。這些研究成果在清除細菌菌膜方面有很大的貢獻，在細菌初始黏附接觸面時就進行迅速全面的清潔，避免其形成微菌落，則會減少細菌的量。在食品工業(yè)，對菌膜形成的預防和對食物被污染與否的及時有效監(jiān)控是關鍵，在菌膜成熟前及早清除，會大大降低食品安全的隱患。

病原菌菌膜形成相關基因的研究是最近幾年菌膜方面的研究熱點，通過對毒力基因的敲除或過表達，根據(jù)其突變株菌膜的生成量，并與正常菌株菌膜的形成量作對比來確定該基因是否參與菌膜的形成過程。也有成功利用轉座子阻斷法來研究與菌膜形成相關基因的報道[39-40]，Tn917轉座子使用比較廣泛，國外有利用該轉座子插入表皮葡萄球菌形成突變體，探討對菌膜形成的影響[41]，國內(nèi)也有利用Tn917轉座子來篩選單核細胞增生李斯特菌菌膜形成突變子的研究[42]，該方法是一種常用的鑒定新基因的方法，從細菌到高等植物都有很廣泛的應用[43]。

一些熟悉的致病菌，如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等，關于其菌膜形成的研究相對成熟，人們對其菌膜形成的影響因素的了解相對深入。相關的研究方法、思考方向及基因的調控為其他致病菌的菌膜研究的開展提供了極其有利的幫助。

在臨床上應用于人體的生物材料容易引起細菌的黏附和菌膜的產(chǎn)生，導致相關感染性疾病及慢性感染的反復發(fā)作；在食品工業(yè)中一旦細菌污染并形成菌膜，不僅會對加工設備、輸送管道表面造成損失，更會造成食品安全問題。國內(nèi)外的許多研究機構都投入了大量的資金和人力去研究菌膜，并獲得了一部分的理論體系，其最終目的是將這些理論及實驗結果應用到臨床和食品工業(yè)中，減少由于菌膜造成的疾病和損失。

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A Review of Factor Affecting Biofilm Formation by Food-Borne Pathogenic Bacteria

WU Man1，LI Sen1，WU Shuyan1，CHEN Guowei1，LIU Fang2，ZHANG Chao1，DONG Qingli1，LIU Qing1，*
（1.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China；2.International Travel Healthcare Center，Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou730020，China）

Bacterial biofi lm is the condition under which microorganisms survive by adhering to the medium surface and forming a large number of bacterial colonies. The dense structure of bacterial biofi lm enables bacteria to survive in adverse environmental conditions. In the food industry, it is impossible to completely eliminate bacterial contamination due to the formation of biofilm. Meanwhile, in the medical field, biofilm is one of the major reasons for repeated attacks and diffi cult control of many chronic and infectious diseases because of the drug resistance. In this paper, the recent progress in understanding of bacterial biofi lm is systematically reviewed, and future development is proposed.

food-borne pathogenic bacteria; biofi lm; influencing factors；food industry

Q935

A

1002-6630（2015）05-0239-05

10.7506/spkx1002-6630-201505044

2014-04-24

國家自然科學基金面上項目（31371776；31271896）

吳嫚（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食源性致病菌致病機理。E-mail：mandywu1247@gmail.com

劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術。E-mail：liuq@usst.edu.cn