植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展

陳龍 梁子寧 朱華

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧　530001）

植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展

陳龍 梁子寧 朱華

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530001）

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一階段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物沒有明顯病害癥狀的一類微生物，研究發(fā)現(xiàn)其主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌。內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)，從而拓寬了藥用資源并且具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。從植物內(nèi)生菌的分布規(guī)律及其生長特點(diǎn)，與宿主植物的關(guān)系，研究領(lǐng)域以及發(fā)展現(xiàn)狀與存在問題等方面進(jìn)行了綜述，并對(duì)植物內(nèi)生菌在藥用資源開發(fā)中的前景進(jìn)行了展望。

植物內(nèi)生菌；與宿主植物關(guān)系；生物活性；研究領(lǐng)域

植物內(nèi)生菌是指其生活史中某一階段或整個(gè)階段生活在生長健康的植物組織或細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物群，其主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌這三種類群［1］。由于近代農(nóng)業(yè)，畜牧業(yè)，食品加工業(yè)幾次重大的中毒事件植物內(nèi)生菌才逐漸引起人們和科學(xué)家的重視。因此，關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究才慢慢的開展起來。直至1993年Stierle報(bào)道了從短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia Nutt.）中能分離出一種能產(chǎn)生抗癌活性成分紫杉醇的內(nèi)生菌［2］。至此人們經(jīng)過數(shù)十年的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌和其宿主之間存在著相互依存及互惠的關(guān)系。目前，人們已經(jīng)漸漸地從植物內(nèi)生菌中尋找到與宿主相似的天然化合物成分，這不僅拓寬了藥用植物資源，同樣也促進(jìn)了對(duì)稀有珍貴物種的保護(hù)和持續(xù)發(fā)展。除此之外，對(duì)植物內(nèi)生菌的次生代謝的研究也悄然展開。近幾年，有研究表明從植物內(nèi)生菌中分離出的次生代謝產(chǎn)物也存在著生物活性成分［3］。當(dāng)前，植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)成為植物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)、農(nóng)藥學(xué)、生藥學(xué)和中藥資源學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的研究開發(fā)價(jià)值。本文就近10年來植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究作如下簡(jiǎn)要綜述。

1 植物內(nèi)生菌的分布規(guī)律

植物內(nèi)生菌普遍存在于植物的根莖葉花果實(shí)等器官和組織細(xì)胞中，并且廣泛地存在于藻類、苔蘚、蕨類植物、裸子植物和被子植物中。目前，植物內(nèi)生菌的研究主要集中在裸子植物和被子植物這兩類植物。內(nèi)生菌的分布規(guī)律取決于宿主本身及內(nèi)生菌的種類，在宿主不同器官的分布存在著差異［4-10］。研究表明，植物內(nèi)生菌的分布規(guī)律受植物的種類、地理位置、生長環(huán)境和氣候條件等因素的影響。因此內(nèi)生菌也具有豐富的生物多樣性。植物內(nèi)生菌的種類繁多，但主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌，其中內(nèi)生真菌是當(dāng)前內(nèi)生菌研究的熱點(diǎn)。

2 內(nèi)生菌與宿主植物之間的關(guān)系

內(nèi)生菌和宿主植物由于二者生活環(huán)境和習(xí)性的不同，因此也決定了二者之間關(guān)系的復(fù)雜性和特殊性。對(duì)于內(nèi)生菌的起源有學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)生菌可能通過多種途徑從宿主體外進(jìn)入宿主體內(nèi)。如宿主植物及種子的表面，自然孔口處或傷口處和直接破壞細(xì)胞壁成分侵入等［11，12］。內(nèi)生菌與宿主在長期共處這種復(fù)雜而又特殊的關(guān)系中，會(huì)因自身生理狀況，環(huán)境變化等內(nèi)外因素的變化而發(fā)生相互轉(zhuǎn)化［11］。同時(shí)，不同的內(nèi)生菌對(duì)宿主的專一性也有很大差別。有的只與一種植物共生，有的可以和多種植物共生［13］。

2.1 內(nèi)生菌對(duì)宿主植物的影響

2.1.1 促進(jìn)宿主植物的生長 許多研究表明，內(nèi)生菌可促進(jìn)宿主植物的生長發(fā)育，增加宿主植物的總生物量，單株花序數(shù)量和種子數(shù)量，提高植物種子的飽滿率和發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗存活和分蘗生長等［14］。內(nèi)生菌的這種促進(jìn)植物生長作用可以從兩方面理解［15-19］。一方面，許多內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生生長素、赤霉素和細(xì)胞激動(dòng)素等植物生長激素；另一方面，內(nèi)生菌能夠增加植物的固氮能力和對(duì)鉀、鈣、磷等營養(yǎng)元素的吸收。

2.1.2 增強(qiáng)宿主植物的抗逆性 內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)宿主植物在不利的外界環(huán)境中的抗性，主要表現(xiàn)在抗旱、耐熱、抗病蟲害和對(duì)病原體拮抗等方面。研究表明，感染內(nèi)生菌的植物比未感染的植物在應(yīng)激環(huán)境中的適應(yīng)性明顯增強(qiáng)。許多資料證明內(nèi)生菌與植物的共生協(xié)助了早期植物在一些惡劣、貧瘠的土壤上生存。當(dāng)植物感染內(nèi)生菌后，其某方面的抗逆性明顯增強(qiáng)，從而提高了該植物在逆境環(huán)境中存活的幾率［10，11，20，21］。

2.1.3 對(duì)宿主植物的毒性作用或抑制作用 內(nèi)生菌在侵染宿主初期或者在長期的共存中，由于外界環(huán)境的改變，以及非寄主生物的入侵而產(chǎn)生有毒物質(zhì)或溶解酶。這種毒性物質(zhì)和溶解酶一般是非專一性的，會(huì)對(duì)宿主植物細(xì)胞組成，植物的生理功能以及對(duì)其敏感的非寄主生物造成毒害損傷或抑制作用，從而促進(jìn)其生長或是獲取有利的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)［11，22，23］。

2.1.4 促進(jìn)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 內(nèi)生菌能夠促進(jìn)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，可能主要由以下兩種原因造成：第一種可能，由于內(nèi)生菌和宿主植物在基因?qū)用娴淖兓a(chǎn)生了信息傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致其與宿主產(chǎn)生相同或相似的次生代謝產(chǎn)物［11，14］；第二種可能，內(nèi)生菌參與了宿主植物體內(nèi)的生物合成代謝。內(nèi)生菌在次生代謝產(chǎn)物的合成途徑中協(xié)同或催化關(guān)鍵酶類或蛋白的合成［24，25］。

2.2 宿主植物對(duì)內(nèi)生菌的影響

內(nèi)生菌對(duì)于植物來說始終是一個(gè)異物。當(dāng)內(nèi)生菌侵入植物體時(shí)，植物自身會(huì)對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。這種反應(yīng)一般可能分為兩種，一種呈現(xiàn)抵抗作用［11，22，23］，如形成機(jī)械障礙；另一種與植物體形成共生結(jié)構(gòu)［26，27］，如蘭科植物的菌根。

2.2.1 宿主植物對(duì)內(nèi)生菌的抵抗反應(yīng) 對(duì)于植物對(duì)侵入自身的內(nèi)生菌的抵抗作用，研究認(rèn)為在宿主植物和侵染的內(nèi)生菌或病原菌都是受特殊基因控制的。特殊基因的調(diào)控作用控制著植物是否具有抵抗作用。當(dāng)植物細(xì)胞表面具有與病原菌表面互補(bǔ)的糖蛋白時(shí)，植物的抵抗作用會(huì)因此受到激發(fā)，其本身產(chǎn)生抗病性。反之，植物由于不能產(chǎn)生抗病性蛋白而感?。?2，28］。

侵入的內(nèi)生菌不能適應(yīng)宿主植物的內(nèi)環(huán)境也是宿主植物對(duì)內(nèi)生菌的抵抗反應(yīng)的一種表現(xiàn)形式，即植物本身不能為寄主內(nèi)生菌的生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長環(huán)境［22，23］，如溫度、溫度、氧氣和酸堿度等。

除此之外，宿主植物體內(nèi)存在著內(nèi)生菌萌發(fā)，生長的抑制因子。如體內(nèi)含有一些化學(xué)成分能夠抑制真菌孢子的萌發(fā)［29］；或是宿主植物本身細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者真菌侵染后的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致宿主植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，給內(nèi)生菌在宿主植物內(nèi)部的定殖、生長和孢子的萌發(fā)形成了機(jī)械障礙［11，22］。如細(xì)胞壁增厚、營養(yǎng)流失等。

2.2.2 宿主植物與內(nèi)生菌形成共生體 有些內(nèi)生菌侵入宿主植物內(nèi)部以后，會(huì)與宿主本身形成一種有規(guī)律的互利結(jié)合的共生體。這種共生結(jié)構(gòu)使內(nèi)生菌和宿主植物在生理結(jié)構(gòu)，營養(yǎng)物質(zhì)輸送，能量分配等方面達(dá)到了一種平衡。這種平衡關(guān)系的建立和穩(wěn)定，是維護(hù)內(nèi)生菌和宿主植物的共生生活的關(guān)鍵，同時(shí)對(duì)于內(nèi)生菌和宿主植物二者本身的生長生活又有互利互惠作用，彼此通過自己本身的生長特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來彌補(bǔ)對(duì)方生長的缺陷或?qū)ν饨缙D苦環(huán)境的適應(yīng)。如蘭科植物天麻和密環(huán)菌，松科植物的菌根菌［30，31］。

2.2.3 內(nèi)生菌對(duì)植物宿主的優(yōu)勢(shì)選擇 宿主植物的內(nèi)環(huán)境是內(nèi)生菌賴以生存的外界環(huán)境。不同的宿主植物對(duì)內(nèi)生菌的影響是不同的。即便是同科同屬中該植物的不同變種，內(nèi)生菌也會(huì)選擇那些利于自己的生長的植物宿主。王梅霞等［32］研究發(fā)現(xiàn)杜仲（Eucommia ulmoides）葉片中內(nèi)生真菌的類群存在著優(yōu)勢(shì)群落現(xiàn)象，而且在兩地之間植物組織中的優(yōu)勢(shì)群落存在著不同程度的差異。

3 植物內(nèi)生菌的研究內(nèi)容

3.1 菌株的分離純化

常采用組織塊法［4-6，33，34］。在宿主細(xì)胞不同組織器官中，如根、莖、葉、花及果實(shí)等取若干克或小塊（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定）并按常規(guī)程序進(jìn)行消毒。無菌條件下將處理后的植物組織（枝條、根的韌皮部或葉子等）切成適當(dāng)大小的小方塊。將其放在PDA或其他培養(yǎng)基上，25-30℃，培養(yǎng)3-7 d。待組織塊段面邊緣有菌絲長出后，挑去前端菌絲轉(zhuǎn)入另一PDA平板培養(yǎng)基，經(jīng)純化，得到單一菌落后，斜面保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)的方法步驟可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。除此之外，還可根據(jù)分離目的的不同，選擇含有不同培養(yǎng)基質(zhì)的分離培養(yǎng)基分離目標(biāo)菌種。如含抑菌劑的培養(yǎng)基，含植物組織提取的培養(yǎng)基和低營養(yǎng)的培養(yǎng)基［35-37］。

3.2 菌株生物形態(tài)特性及種類鑒定

內(nèi)生菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理結(jié)構(gòu)易受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，給研究菌株工作帶來了很大的難度。利用生物形態(tài)學(xué)特性研究，不僅能夠確定菌株的性狀大小，顏色紋飾和菌落形態(tài)和質(zhì)地等生理習(xí)性，同時(shí)又能為菌株的分類鑒定提供依據(jù)［38，39］。因此對(duì)菌株生物特性研究已經(jīng)成為人們研究內(nèi)生菌的一項(xiàng)重要方法。通常對(duì)菌株生物特性研究主要分為營養(yǎng)因子和物理化學(xué)因子兩部分［23，38，39］。如菌株的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、維生素等營養(yǎng)因子和溫度，濕度、光照、空氣和PH值等物理化學(xué)因子。

由于內(nèi)生菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，所以通過菌絲形態(tài)、產(chǎn)飽結(jié)構(gòu)和形態(tài)，依靠生物形態(tài)學(xué)鑒定已難以準(zhǔn)確鑒定出內(nèi)生菌的屬種。分子生物學(xué)方法是通過測(cè)定菌株的核酸組成來判斷菌株的親緣關(guān)系，從而克服和彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的不足［38-40］。目前，對(duì)于菌株的鑒定主要采取以分子生物學(xué)方法為主，經(jīng)典生物形態(tài)學(xué)觀察法為輔的方式來確定菌株的屬種。

3.3 菌株及其次生代謝產(chǎn)物的生物活性及成分研究

植物內(nèi)生菌及其次生代謝活性成分通常具有抗腫瘤、抑菌及殺蟲的作用［3-5，10，41-43］。因此，通過分離植物內(nèi)生菌來獲得具有生物活性的化學(xué)成分研究已經(jīng)成為醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域開發(fā)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。相關(guān)研究文獻(xiàn)表明，其作用機(jī)制主要分別為阻斷或干擾促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂的關(guān)鍵酶類及蛋白質(zhì)的合成，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，或是阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成及表達(dá)，最終致使細(xì)菌正常生理功能受損而死亡以及產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的成分改變害蟲的生理功能或細(xì)胞結(jié)構(gòu)［9，22，28，41-44］。隨著分離純化技術(shù)的快速發(fā)展，以及高效液相、氣質(zhì)聯(lián)用及核磁共振等化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定新技術(shù)和方法的應(yīng)用。從植物內(nèi)生菌種分離出的藥用活性成分不斷增加，主要包括多糖、多肽類、萜類、醌類、黃酮類、生物堿類、芳香類和脂肪酸類等化合物［8，9，25，39，41-48］。

4 內(nèi)生菌在藥用植物中的研究現(xiàn)狀

經(jīng)過不斷的研究探索，我們可以確定植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的特有藥用成分，這不僅拓寬了藥用資源，同時(shí)也使一些瀕臨滅絕的珍貴物種得到一定程度的保護(hù)。除此之外，內(nèi)生菌還影響著藥用植物的道地性［13，14］。但是從眾多研究實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)記載中可以看出，藥用植物內(nèi)生菌的研究主要集中在被子植物和裸子植物，而在蕨類植物和苔蘚類植物的研究非常少。同樣，對(duì)內(nèi)生真菌的研究也要比內(nèi)生細(xì)菌和放線菌多，研究有益菌比有害菌多，并且研究的方法和手段比較單一，而對(duì)于內(nèi)生菌的起源以及作用機(jī)理目前還不明確［49］。

5 展望

綜上所述，植物內(nèi)生菌種類豐富蘊(yùn)藏量大，加之其特殊的生存方式，因此對(duì)于藥用資源的開發(fā)，是一個(gè)擁有巨大開發(fā)潛力的寶庫。但目前對(duì)植物內(nèi)生菌的研究還處于探索階段，研究的領(lǐng)域比較有限。例如，對(duì)植物內(nèi)生菌的研究多，而對(duì)動(dòng)物內(nèi)生菌的研究較少［50］。在研究方法和技術(shù)上，對(duì)植物內(nèi)生菌的研究也主要集中在對(duì)能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌篩選上，其涉及的研究領(lǐng)域比較局限。未來的研究中應(yīng)重視內(nèi)生菌起源以及與宿主植物之間作用機(jī)理的研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances in the Studies of Plant Entophytic

Chen Long Liang Zining Zhu Hua
（Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning530001）

Entophyte is a kind of micro living organism that lives within a plant for at least a certain period of its life without causing apparent symptoms of disease to the plant. The studies found out that it mainly includes entophytic bacteria， entophytic fungi， and entophytic actinomycetes. Entophyte can produce active substances similar to that of the host plant， which thereby broadens the medicinal resources and correspondingly have a great application value. The authors summarize the following aspects: the distribution patterns and growing characteristics of entophyte， its symbiotic relationship with the host plant， its research fields and current situation of development， together with existing problems. Also， authors forecast the prospects of entophytes utilized in the development of medicinal resources.

plant entophyte；symbiotic relationship with the host plant； bioactivity； research field

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.005

2014-11-19

廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃（YCSZ2014171），廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFAA053119）

陳龍，男，碩士研究生，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用；E-mail：chenglong198808@yeah.com

梁子寧，博士，副教授，研究方向：藥用植物資源評(píng)價(jià)與開發(fā)利用；E-mail：381668307@qq.com