莫昌院，覃 嵐，孟 姣，李玉武，楊雪貞，程振濤

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是山羊的高度接觸性傳染病，被國(guó)際獸疫局列為B類動(dòng)物疫病，臨床上以高熱、卡他性鼻液、咳嗽、眼結(jié)膜炎、呼吸道啰音、纖維素性胸膜炎以及部分母羊流產(chǎn)、進(jìn)行性消瘦為主要特點(diǎn)［1］。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，引起山羊傳染性胸膜肺炎的支原體有多種，我國(guó)羊傳染性胸膜肺炎病原主要為絲狀支原體山羊亞種(Mmc)和綿羊肺炎支原體(Mo)［2］，其中較早資料多認(rèn)為病原為 Mmc，但近年來(lái)全國(guó)各地不斷報(bào)道Mo引起的CCPP病例，且呈逐年上升趨勢(shì)。1999年，貴州省也曾報(bào)道CCPP病例的發(fā)生，且病原為 Mmc［3］。2010年，貴州省首次報(bào)道發(fā)病山羊組織中分離到Mo菌株［4］。因臨床上2種病原感染所致癥狀很難區(qū)分，最終診斷尚需實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病料與菌株 臨床病例材料采自貴州省開陽(yáng)縣某養(yǎng)殖場(chǎng);絲狀支原體山羊亞種標(biāo)準(zhǔn)株(PG3)、綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98均由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑 DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物(大連)科技有限公司;支原體肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 病原分離培養(yǎng)與初步鑒定

1.3.1 培養(yǎng)基制備:(1)液體培養(yǎng)基:取支原體肉湯培養(yǎng)基2.752 g，蒸餾水80 mL加熱溶解，調(diào)pH值至7.4 ～7.6，分裝試管(4 mL/支)，121 ℃高溫高壓滅菌30 min后，每支試管加入馬血清(終濃度200 mL/L)、10%醋酸鉈(終濃度20 mL/L)、青霉素(終濃度200 IU/mL)。(2)固體培養(yǎng)基:取支原體肉湯培養(yǎng)基2.752 g、瓊脂粉1 g、蒸餾水80 mL加熱溶解，調(diào) pH 值至7.4～7.6，121℃高溫高壓滅菌30 min后，待冷卻至70℃左右加入馬血清(終濃度200 mL/L)、10%醋酸鉈(終濃度20 mL/L)、青霉素(終濃度200 IU/mL)，混勻，無(wú)菌分裝平皿。以上培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病原分離培養(yǎng):無(wú)菌采集病羊肺組織，用剪刀剪碎后放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng) 3～7 d，待培養(yǎng)基顏色變化后，用0.45 μm微孔濾器過(guò)濾，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，同時(shí)接種固體培養(yǎng)基，每隔2～3 d觀察1次，待出現(xiàn)單個(gè)菌落，挑取接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。如此連續(xù)傳代純化3次以上。

1.3.3 形態(tài)學(xué)鑒定:將純化的菌株接種固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3～7 d觀察生長(zhǎng)狀況，至出現(xiàn)針尖大小透明菌落，置低倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

1.3.4 生化鑒定:按照OIE提供的生化試驗(yàn)方法，對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行細(xì)菌L型還原試驗(yàn)合格后，作發(fā)酵葡萄糖、水解精氨酸、分解尿素、分解甘露醇、四氮唑還原試驗(yàn)，同時(shí)以Mmc標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G3、綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98作對(duì)照。

1.4 病原核酸PCR檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成:參照GenBank Mo標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因序列(登錄號(hào):NR-025989)，設(shè)計(jì)合成特異性引物Mo1/Mo2(見表1)，送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 Mo 16S rRNA基因引物序列

1.4.2 病原核酸檢測(cè):取支原體液體培養(yǎng)物應(yīng)用DNA提取試劑盒提取所需DNA樣本。以引物Mo1/Mo2對(duì)所提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立50.0 μL體系:10 ×buffer(含 Mg2+)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，引物Mo1/Mo4(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板3 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共34個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

圖1 菌落形態(tài)

2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 見表2。

表2 生化鑒定結(jié)果

由表2可見，本試驗(yàn)支原體分離株生化試驗(yàn)結(jié)果與綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98完全相同，而與Mmc標(biāo)準(zhǔn)株存在差異。

2.3 PCR鑒定結(jié)果 初步確定分離株為Mo后，為進(jìn)一步確定支原體分離株分類地位，用PCR方法對(duì)支原體分離培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，以標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因特異性引物對(duì)分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2。由圖2可見，支原體分離株可擴(kuò)增出與Mo標(biāo)準(zhǔn)株大小一致的1 149 bp目的條帶，進(jìn)一步確定所分離支原體確為Mo。

2 結(jié)果

2.1 病原分離與形態(tài)觀察 液體培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色;經(jīng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，低倍鏡觀察，可見分離菌株菌落不呈典型的支原體“油煎蛋”狀，而呈圓形凸起，無(wú)中心臍。見圖1。

圖2 支原體分離株P(guān)CR鑒定

3 結(jié)論與討論

3.1 我國(guó)自20世紀(jì)40年代在甘肅有本病報(bào)道后，內(nèi)蒙古、四川、河北、云南、江西等地相繼有臨床病例報(bào)道［5，6］。王棟等［7］對(duì)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存的CCPP病原進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些病原在形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和血清學(xué)反應(yīng)方面均與絲狀支原體山羊亞種(Mmc)國(guó)際模式株P(guān)G3一致，因而認(rèn)為引起我國(guó)CCPP的病原應(yīng)該是Mmc。而后國(guó)內(nèi)研究者先后從甘肅、遼寧等地分離到致病性綿羊肺炎支原體(Mo)［8］。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，Mmc和Mo為山羊傳染性胸膜肺炎的主要病原。在貴州，萬(wàn)一元等［9］2001年于羅甸等地分離到 Mmc，2011 年張雙翔等［4］首次分離到Mo。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，綿羊肺炎支原體感染病例在我省山羊病例中持續(xù)存在，且存在區(qū)域擴(kuò)大趨勢(shì)。

3.2 目前，我國(guó)對(duì)CCPP病原鑒定工作多基于分離培養(yǎng)技術(shù)及生化試驗(yàn)，但存在諸多困難，一是支原體個(gè)體微小，生物合成代謝能力有限，營(yíng)養(yǎng)要求高，人工培養(yǎng)增殖難度較大，致使其分離培養(yǎng)也十分困難;二是僅通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化鑒定等方法難以準(zhǔn)確確定支原體分類地位。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)成為鑒定支原體的有效手段［10］。本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)特性等傳統(tǒng)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果顯示，分離株與綿羊肺炎支原體模式株Y98相符，與絲狀支原體山羊亞種模式株P(guān)G3存在差異，初步判定分離株為Mo，命名為 Mo-GZ-03。研究資料表明，16S rRNA基因序列分析是鑒定支原體種屬的一個(gè)可靠方法［11］。綜合分離株的菌落形態(tài)、生化試驗(yàn)特點(diǎn)以及PCR檢測(cè)結(jié)果，可證明本次疫情病原分離株為綿羊肺炎支原體，為疫情的有效控制提供了理論依據(jù)。

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