莫云富

(貴州省黔南州水產(chǎn)工作站，貴州 都勻 558000)

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，簡(jiǎn)稱(chēng)Tf)能夠在機(jī)體內(nèi)可逆而緊密地結(jié)合三價(jià)鐵離子，并參與鐵的運(yùn)輸和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，能夠廣泛參與機(jī)體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)并直接關(guān)系到氧的利用和代謝［1］。本文采用聚丙烯酰胺垂直凝膠電泳法(PAGE)對(duì)元江鯉和建鯉血清轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行了初步探究，通過(guò)分析和比較2種鯉魚(yú)種內(nèi)和種間血清轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳表型，了解這2種鯉魚(yú)種內(nèi)和種間生化遺傳組成和種質(zhì)純度，為2種鯉魚(yú)的人工選育、種質(zhì)鑒定和種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考資料，對(duì)于進(jìn)一步研究不同雜交組合獲得的子代的生產(chǎn)性狀具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)來(lái)源及處理 元江鯉來(lái)源于云南省元江縣元江鯉原種場(chǎng)，平均體重0.3 kg，體長(zhǎng)12 cm;建鯉來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，平均體重1.2 kg，體長(zhǎng)25 cm。2種魚(yú)均為雄魚(yú)，年齡為2齡。從活魚(yú)的尾柄部側(cè)線(xiàn)處取血1 mL左右，4℃下4 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于試管中，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和藥品 電泳儀(DYY—4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀)、電泳槽(DYCZ—22A型電泳槽)、丙烯酰胺單體貯液、分離膠緩沖液貯液、濃縮膠緩沖液貯液、電極緩沖液、0.005 mol/L Tris-Hcl、0.4% 伊凡諾、0.1%考馬斯亮藍(lán)、5%固定液，藥品均為分析純。1.3 樣品制備 將血清純化后電泳，電泳結(jié)束后用0.1%考馬斯亮藍(lán)溶液進(jìn)行染色，最后用脫色液脫色直至底板顏色褪盡譜帶清晰。

1.4 凝膠及緩沖液配制 分離膠和濃縮膠系統(tǒng)分別按表 1［2，3］、表 2［2～5］中的配方嚴(yán)格進(jìn)行配制。

表1 分離膠系統(tǒng)配方

表2 濃縮膠系統(tǒng)配方

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用伊凡諾純化的方法，使得血清蛋白的多組成分被離心去除，因此伊凡諾純化后的血清其主要成分認(rèn)為就是Tf。2種鯉魚(yú)的Tf樣品經(jīng)8%不連續(xù)PAGE分離展現(xiàn)出清晰的譜帶，均出現(xiàn)3個(gè)區(qū)域，而中間區(qū)域的電泳圖譜卻不盡相同。將具有相同Tf電泳表型的個(gè)體鑒定為同一品系，不同Tf表型的個(gè)體認(rèn)為是不同的品系。等位基因命名依其電泳遷移速度的大小，從陽(yáng)極到陰極依次用小寫(xiě)字母 a、b、c、……表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 元江鯉的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果 10尾元江鯉的血清純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果中分析鑒定出5 種 Tf表型(見(jiàn)圖 1)，有 Tfa、Tfb、Tfc、Tfd、Tfe5 個(gè)等位基因，其中顯示3條帶的3種表型 Tfabc、Tfabd、Tfbce;顯示4條帶的1種表型Tfabcd;顯示2條帶的1種表型Tfbc。

圖1 10尾元江鯉PAGE電泳圖譜及模式圖

2.2 建鯉的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果 10尾建鯉的血清純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果中分析鑒定出5種Tf表型(見(jiàn)圖2)，有 Tfa、Tfb、Tfc、Tfd4 個(gè)等位基因，其中顯示3條帶的1種表型Tfbcd;顯示2條帶的4種表型 Tfab、Tfac、Tfbc、Tfbd。

圖2 10尾建鯉PAGE電泳圖譜及模式圖

3 討論分析

3.1 元江鯉種內(nèi)Tf表型差異分析 10尾元江鯉的血清純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果中顯示3條帶表達(dá)量最高，同時(shí)Tfa、Tfb、Tfc3個(gè)等位基因的頻率最高，可以初步推斷Tfa、Tfb、Tfc這3個(gè)等位基因是原始基因。其他基因可能是在自然選擇中由于基因頻率的隨機(jī)變動(dòng)，出現(xiàn)蛋白質(zhì)的過(guò)渡性多態(tài)現(xiàn)象或者是變異而來(lái)［6］。

3.2 建鯉種內(nèi)Tf表型差異分析 10尾建鯉的血清純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白電泳結(jié)果中顯示2條帶表達(dá)量最高，同時(shí)Tfa、Tfb、Tfc3個(gè)等位基因的頻率最高，可以初步推斷Tfa、Tfb、Tfc這3個(gè)等位基因是原始基因。其他基因可能是在自然選擇中由于基因頻率的隨機(jī)變動(dòng)，出現(xiàn)蛋白質(zhì)的過(guò)渡性多態(tài)現(xiàn)象或者是變異而來(lái)［6］。

3.3 2種鯉魚(yú)種間Tf表型差異分析 通過(guò)PAGE電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在隨機(jī)各自抽取的10尾鯉魚(yú)中，Tf表型和基因型存在一定的差異，而且等位基因的表達(dá)強(qiáng)弱也因品種的不同而呈現(xiàn)差異現(xiàn)象。表型的多樣性很可能是由于等位基因的不同引起的，也可能是血清的活性強(qiáng)弱、顏色濃淡及遷移率不盡相同，具有組織特異性的原因，或者是種內(nèi)生化遺傳特征和種質(zhì)純度不盡相同所致。元江鯉和建鯉Tf表型均由 Tfa、Tfb、Tfc3個(gè)等位基因決定，即為共同顯示的優(yōu)勢(shì)等位基因，這可能是由于建鯉是以特定的荷包紅鯉和元江鯉為親本，采用家魚(yú)選育、系間雜交及染色體組工程(雌核發(fā)育)等綜合育種的新工藝，經(jīng)6代定向選育育成的良種所導(dǎo)致的具有一定的親緣關(guān)系。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果使我們對(duì)2種鯉魚(yú)種內(nèi)、種間生化遺傳特征和種質(zhì)純度有了初步了解，并初步建立了這2種鯉魚(yú)的父本血清轉(zhuǎn)鐵蛋白圖譜庫(kù)。但本試驗(yàn)所采用的魚(yú)都是雄魚(yú)而且數(shù)量有限，如果用于試驗(yàn)的魚(yú)數(shù)量足夠多，電泳設(shè)計(jì)更加合理，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多品系和更為明顯差異。作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白PAGE圖譜的差異在某種程度上可以反映物種遺傳基礎(chǔ)上的差異，但魚(yú)類(lèi)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白中多數(shù)性狀是由多個(gè)基因控制，用電泳技術(shù)能檢測(cè)出的基因差異目前還在少數(shù)，因此在生化遺傳學(xué)上的差異以及這些差異的穩(wěn)定性尚有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ Aise P.Listowsky I.Irom tanspot andstoragproteins.Ann.Rev.Biochem［J］.1980，49:357 ～393.

［2］ 胡能書(shū)，萬(wàn)賢國(guó).同工酶技術(shù)及其應(yīng)用［M］.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985.73 ～85.

［3］ 吳鶴齡，林錦湖.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1984.272 ～275.

［4］ 朱藍(lán)菲.魚(yú)類(lèi)同工酶和蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳法［J］.水生生物學(xué)報(bào)，1992，16(2):183 ～185.

［5］ 李思發(fā).上海水產(chǎn)大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源研究室魚(yú)類(lèi)電泳手冊(cè)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1994.

［6］ 龍華，曾勇，李谷.魚(yú)類(lèi)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25(2):181 ～187.