鄒李昶　任夙藝　王志錚①　朱衛(wèi)東　吳一挺

(1. 浙江海洋學院　舟山　316022; 2. 余姚市水產(chǎn)技術推廣中心　余姚　315400; 3. 舟山市海洋與漁業(yè)局　舟山　316000)

氨氮作為含氮化合物的主要最終產(chǎn)物和積聚于水體中的重要無機污染物(Coltet al, 1981; Alonsoet al, 2004; Prenteret al, 2004), 既是評價水域環(huán)境質量的重要監(jiān)測指標, 也是反映水產(chǎn)養(yǎng)殖動物存活狀況的重要環(huán)境因子。已有研究表明, 氨氮既能直接損害甲殼動物的鰓組織, 也可通過滲入血淋巴引起甲殼動物免疫力下降, 代謝機能紊亂和病原致敏性提高(Chenet al, 1992b; Ackermanet al, 2006; Spenceret al,2008; Sunget al, 2011; 蔣琦辰等, 2013), 故極易引發(fā)甲殼動物爆發(fā)性疾病的發(fā)生。日本沼蝦Macrobrachium nipponensis(De Haan, 1849)系我國重要的淡水蝦類養(yǎng)殖對象之一, 池塘高密度養(yǎng)殖往往會導致堆積于池底的大量殘餌經(jīng)氨化作用使水體中氨氮濃度急劇升高, 因而系統(tǒng)地開展氨氮對日本沼蝦的毒害作用與機制研究, 并據(jù)此探析進而確定其氨氮安全耐受限量, 無疑對指導該蝦的安全養(yǎng)殖生產(chǎn)具重要現(xiàn)實意義。

研究表明, NH3對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物具強毒性(Alonsoet al, 2004), 雖然其在氨氮中的存在比例主要受制于水體中的溫度、pH和鹽度(Chenet al, 1992a, 1993),但溶解氧也將直接影響其毒性作用的發(fā)揮。據(jù)報道, 非離子氨的毒性與水中溶解氧含量呈負相關(Thurstonet al, 1981), 高溶解氧可顯著提高羅氏沼蝦(王龍等,2011)和中國對蝦(王娟等, 2007)等甲殼動物對非離子氨的耐受能力。但目前國內外關于氨氮對日本沼蝦生態(tài)毒理方面的研究, 僅涉及受氨氮脅迫下飼料中添加維生素 C對日本沼蝦耗氧率、排氨率及 Na+/K+ATPase的影響(Wanget al, 2003), 以及持續(xù)充氧條件下氨氮急性脅迫對日本沼蝦酚氧化酶活力、血細胞數(shù)量及血藍蛋白含量的影響(張亞娟等, 2008, 2010), 而有關靜水實驗條件下氨氮對該蝦的急性毒害作用及其安全耐受限量的定量研究則迄今尚未見報道。基于此, 本文作者于2010年8—9月采用靜水停食法在余姚市水產(chǎn)技術推廣中心實驗基地內就氨氮對日本沼蝦死亡率、耗氧率及窒息點的影響開展了較為系統(tǒng)的研究, 在獲悉氨氮對該蝦的急性致死作用并求得 96h LC50值后, 采用SC = 0.1×96h LC50(Sprague, 1971)估算氨氮安全質量濃度, 并以此為終點設置實驗質量濃度梯度, 通過測定耗氧率和窒息點, 在核驗該估算值可靠性的同時, 確定該蝦的安全耐受限量。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1日本沼蝦購自余姚市馬渚鎮(zhèn)青豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場, 運回實驗基地馴養(yǎng)4—5d(馴養(yǎng)期間不投喂飼料)后, 選取其中肢體完好、規(guī)格相近、反應敏捷的健壯個體作為實驗對象, 具體規(guī)格為體長(4.29±0.32)cm、體質量(1.80±0.12)g。

1.1.2試劑NH4Cl和液體石蠟均為AR級, 分別購自國藥集團化學試劑有限公司和無錫市晶科化工有限公司。按需用雙蒸水將 NH4Cl制成一定質量濃度的母液, 現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3理化條件以自然曝氣 48h的自來水為實驗用水, 水溫(24±0.2)°C, pH 7.61±0.04, DO (7.24±0.14)mg/L, 水質符合《NY 5051-2001無公害食品 淡水養(yǎng)殖用水水質》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部, 2001)要求。

1.2　實驗方法

1.2.1氨氮對日本沼蝦的急性毒性實驗在室溫條件下, 以規(guī)格60cm×35cm×30cm的白色塑料箱為實驗容器(實驗實際容積為20L), 依次設0(對照組)、1.346、2.355、3.701、5.720、9.421mg/L等6個實驗梯度(每一梯度設3個平行, 每個平行放實驗蝦10尾),采用靜水停食實驗法開展氨氮對日本沼蝦的急性毒性實驗。實驗期間, 連續(xù)觀察實驗蝦的活動狀況, 并按王志錚等(2013)確定的死亡個體判定標準及時取出死亡個體, 每24h換液并統(tǒng)計1次總體死亡率。

1.2.2氨氮對日本沼蝦耗氧率和窒息點的影響實驗依次設 0(對照組)、0.056、0.112、0.169、0.225、0.281和0.337mg/L等 6個實驗梯度, 并按王志錚等(2013)的實驗方法開展氨氮對日本沼蝦耗氧率和窒息點的影響實驗, 實驗時間均始于22:00。

1.3　數(shù)據(jù)處理

根據(jù)急性毒性實驗結果, 建立 24h、48h、72h、96h等不同觀察時段氨氮質量濃度(x)與日本沼蝦死亡概率單位(y)間的直線回歸方程; 應用 SC = 0.1×96h LC50求得氨氮安全質量濃度估算值, 并借助各實驗時段MAC值(王志錚等, 2007)的變化特征分析實驗蝦對氨氮的蓄積與降減動態(tài); 晝、夜區(qū)間耗氧率的統(tǒng)計時段分別按6:00至18:00和18:00至翌日6:00, 并采用 LSD多重比較法分別檢驗耗氧率、窒息點的組間差異顯著性(a=0.05)。上述統(tǒng)計分析均借助 SPSS 17.0軟件來完成。

2　結果

2.1　急性毒性死亡率與死亡癥狀

除對照組外, 相同氨氮質量濃度組日本沼蝦的死亡率均隨實驗時間的延長而增加, 相同實驗時段內日本沼蝦的死亡率均隨氨氮質量濃度的提高而增加(圖1)。觀察發(fā)現(xiàn), 瀕死實驗蝦鰓組織均出現(xiàn)不同程度的受損變白癥狀, 且該癥狀隨氨氮質量濃度增大和攻毒時間延長而變得愈加明顯, 表明鰓是氨氮攻毒日本沼蝦的重要靶器官, 氨氮攻毒該蝦的時間—劑量效應與其鰓組織受損情形關聯(lián)密切。

圖1　氨氮對日本沼蝦的急性毒性Fig.1　Acute toxicity of ammonia-N on M. nipponensis

2.2　急性致毒特征

日本沼蝦24h、48h、72h、96h的LC50值分別為7.922、6.034、4.237 和 3.371mg/L(表1); 經(jīng)計算, 實驗24—48h、48—72h、72—96h時段的MAC值依次為41.5%、39.5%和19.0%, 表明氨氮對日本沼蝦的致死作用強度與實驗時間呈正相關, 而在其體內的蓄積作用強度卻與實驗時間呈負相關。經(jīng)估算, 日本沼蝦對氨氮的安全質量濃度為0.337mg/L。

2.3　耗氧率

由圖2可見, 各實驗組和對照組在時段耗氧率間的變化上均趨于一致, 且耗氧率均呈夜均＞日均＞晝均, 表明各實驗組日本沼蝦的呼吸生理節(jié)律均未發(fā)生實質性改變; 與此同時, 各時段及夜均、日均、晝均耗氧率隨氨氮質量濃度的梯次增加均呈“∩”型走勢的結果, 進一步表明本研究質量濃度范圍內的氨氮可致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應(hormesis)。

表1　氨氮對日本沼蝦的急性致毒特征Tab.1　The acute toxic characteristic of ammonia-N to M. nipponensis

圖2　氨氮對日本沼蝦耗氧率晝夜節(jié)律的影響Fig.2　The effect of ammonia-N on oxygen consumption rate of circadian rhythm in M. nipponensis

由圖2可知, 在本研究所設各實驗組中, 各時段耗氧率以及晝均、夜均和日均耗氧率均以氨氮質量濃度 0.225mg/L實驗組為最高(P＜0.05), 而 0.337mg/L實驗組不僅晝均、夜均耗氧率與對照組均無差異(P＞0.05), 且在所觀測的12個時段中耗氧率與對照組無差異(P＞0.05)的時段也多達 9個, 為本研究諸實驗組中與對照組耗氧率相似性最高的實驗組別, 故致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應峰值的氨氮質量濃度為 0.225mg/L, 而致日本沼蝦毒物興奮效應被終止的氨氮質量濃度則為0.337mg/L。

2.4　窒息點

由圖3可見, 實驗組窒息點氧含量隨氨氮質量濃度的增加依次呈穩(wěn)定、略增、再穩(wěn)定之態(tài)勢。其中, 對照組窒息點氧含量僅與0.056mg/L、0.112mg/L氨氮質量濃度實驗組無顯著差異(P＞0.05), 氨氮質量濃度0.169、0.225、0.281和0.337mg/L實驗組窒息點氧含量間均無顯著差異(P＞0.05), 與對照組和氨氮質量濃度 0.169mg/L實驗組窒息點氧含量均無顯著差異(P＞0.05)的組別僅為0.112mg/L實驗組, 表明致該蝦窒息點發(fā)生顯著改變的氨氮臨界閾質量濃度為0.112mg/L。

圖3　氨氮對日本沼蝦窒息點的影響Fig.3　Effects of ammonia-N on the suffocation point of M. nipponensis

3　討論

Thurston等(1981)指出, 非離子氨對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的毒害作用強度與水中溶解氧含量呈負相關。據(jù)報道, 水溫(23±1)°C、pH 7.11±0.07 條件下, 非離子氨對全長3cm左右羅氏沼蝦溶解氧7mg/L、11mg/L實驗組的96h LC50值分別為0.83 mg/L和1.425 mg/L (王龍等, 2011); 水溫21°C、鹽度30—31、pH 7.99條件下, 非離子氨對體長1.9—2.1cm中國對蝦溶解氧5.5—6.0mg/L、10—12mg/L實驗組的96h LC50值分別為0.98mg/L和1.52mg/L (王娟等, 2007)。研究發(fā)現(xiàn), 體長3.5—4.1cm的日本沼蝦在水溫(25.0±1)°C條件下,饑餓2d內的超氧陰離子OD值與對照組無顯著差異(P＞0.05), 且其 SOD、CAT活力均顯著大于對照組(P＜0.05), 饑餓4d時不僅其超氧陰離子OD值顯著高于對照組(P＜0.05), 而且SOD、CAT活力也均顯著低于對照組(P＜0.05), 饑餓6d后其超氧陰離子OD值極顯著高于對照組(P＜0.01), 且SOD、CAT活力均極顯著低于對照組(P＜0.01)(李志華等, 2007), 體長 4.2—5.2cm的日本沼蝦在水溫20°C條件下, 其饑餓代謝適應區(qū)和饑餓存活適應區(qū)分別為饑餓處理 2—4d和饑餓處理8—10d , 且SOD活力隨饑餓時間的延長而顯著下降(張靜等, 2007), 表明饑餓4d為日本沼蝦的免疫抗逆能力和代謝水平出現(xiàn)顯著下滑的臨界點。故在水溫、pH及實驗蝦體長和體質量規(guī)格均相近條件下,停食1d后連續(xù)充氣培養(yǎng)的日本沼蝦受氨氮質量濃度36.6mg/L攻毒24h后的成活率仍為100% (張亞娟等,2008, 2010), 而本研究所獲氨氮對日本沼蝦的 24h LC50值則僅為 7.922mg/L (停食馴養(yǎng) 4—5d后開始實驗, 實驗期間不充氣)的根本原因, 無疑為兩者間在實驗供氧方式和實驗用蝦馴養(yǎng)方法選擇上的差異共同所致。據(jù)報道, 在與本研究相同水溫及相近 pH條件下, 體質量(0.942±0.187)g的日本沼蝦受氨氮攻毒的96h LC50值為36.6mg/L (Wanget al, 2003), 遠高于本研究所獲的 3.371mg/L [實驗蝦體質量為(1.80±0.12)g], 表明日本沼蝦養(yǎng)成后期對氨氮攻毒更具敏感性。綜上, 為進一步規(guī)避養(yǎng)殖風險, 應在該蝦養(yǎng)殖后期切實提高其生長所需的食物和溶氧保障水平。

毒物興奮效應是生物長期進化過程中為提高在各種低水平脅迫下的成活率而形成的一種順應自然選擇的生理機制, 意在當生物體內穩(wěn)態(tài)(homostatic)受損后能迅速獲得恢復(Calabreseet al, 2001)。據(jù)報道, 非離子氨對甲殼動物的毒害作用往往表露為鰓組織受損及血淋巴 pH的改變(Coltet al, 1981;Romanoet al, 2007), 水環(huán)境中過高質量濃度的非離子氨不僅會導致甲殼動物耗氧量的增加和血藍蛋白濃度的下降(Chenet al, 1994; Racpttaet al, 2000), 而且也將直接妨礙鰓的排氨作用(Spiceret al, 1994;Maltby, 1995)。因此, 張亞娟等(2008, 2010)所報道的日本沼蝦酚氧化酶活力、血細胞數(shù)量和血藍蛋白含量均隨水環(huán)境中氨氮質量濃度的增加而呈先升后降趨勢, 在連續(xù)充氣狀態(tài)下血藍蛋白含量達到峰值的氨氮質量濃度為 2.2mg/L (P＜0.05), 遠低于酚氧化酶活力和血細胞數(shù)量均達到峰值的氨氮質量濃度8.7mg/L(P＜0.05)的情形, 與本研究中瀕死日本沼蝦鰓組織受損變白癥狀隨氨氮質量濃度增大和攻毒時間延長而變得愈加明顯的現(xiàn)象, 以及隨氨氮質量濃度的梯次增加, 日本沼蝦各時段耗氧率及夜均、日均、晝均耗氧率均呈“∩”型走勢(圖2)和窒息點呈穩(wěn)定、略增和再穩(wěn)定之態(tài)勢(圖3)的結果, 均表明以呼吸生理補償為代價的內穩(wěn)態(tài)保持機制是引發(fā)日本沼蝦受氨氮急性脅迫下其耗氧率表露毒物興奮效應的主因, 這就為人們從呼吸生理變化特征的角度來進一步表征氨氮對日本沼蝦的安全質量濃度提供了重要的證據(jù)支持。目前, 國內外有關毒物對目標水產(chǎn)養(yǎng)殖動物安全質量濃度值的估算多采用SC = 0.1×96h LC50, 因96h LC50值具相應的置信區(qū)間, 故實際上SC值的設定也應具上、下限。由此, 在致日本沼蝦耗氧率表露毒物興奮效應的氨氮質量濃度范圍內, 可將0.112mg/L這一致日本沼蝦尚未越過該效應耗氧率峰值且窒息點氧含量處于臨界閾水平的氨氮質量濃度, 定義為日本沼蝦安全質量濃度取值范圍的下限; 將 0.337mg/L這一致日本沼蝦耗氧率終止毒物興奮效應且窒息點含氧量顯著高于對照組(P＜0.05)的氨氮質量濃度(圖2, 圖3), 定義為日本沼蝦安全質量濃度取值范圍的上限, 其與急性毒性實驗所獲的估算值(SC = 0.1×96h LC50)完全一致(表1)。

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