張　雪　令狐青青　童曉倩　毛貴珠　羅紅宇　宋　茹

(浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院　舟山　316022)

魷魚(Ommastrephes bartrami)屬海洋頭足類, 無脊椎軟體動(dòng)物, 富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)及維生素等多種營養(yǎng)成分, 是我國一種非常重要的水產(chǎn)品加工原料。魷魚在加工過程中大約產(chǎn)生 15%—30%的頭、足、內(nèi)臟及表皮等廢棄物, 其中魷魚皮約占廢棄物總量的 8%—10%, 主要由結(jié)構(gòu)蛋白——膠原蛋白組成(郭無瑕等, 2006)。以往膠原蛋白的提取主要從陸地動(dòng)物的皮、骨、筋腱中獲得, 但是近年來由于一些人畜共患病爆發(fā), 如: 瘋牛病、禽流感、口蹄疫等,陸地動(dòng)物源膠原蛋白的安全性引發(fā)公眾關(guān)注。相比之下, 海洋動(dòng)物源膠原蛋白則具有更高的安全性, 魷魚皮中膠原蛋白除了可以直接食用外, 還富含甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸, 對(duì)皮膚有良好的修復(fù)和滋養(yǎng)作用。此外, 國內(nèi)外大量研究還報(bào)道魷魚皮膠原蛋白水解液具有抗氧化、降血壓、調(diào)血脂、提高免疫力等生理活性(劉克海等, 2008; Giménezet al, 2009; Alemánet al, 2011, 2013; Gómez-Guillénet al, 2011; LINet al,2012; Veerurajet al, 2015)。

膠原蛋白可以采用酸法、堿法和酶法提取, 但是顏色較深的膠原蛋白提取液需要經(jīng)過適宜的脫色處理才能進(jìn)一步應(yīng)用。蛋白質(zhì)及其水解液的脫色主要采用化學(xué)法和物理法, 化學(xué)脫色法因?yàn)榧尤胙趸突蜻€原型化學(xué)試劑, 所以對(duì)脫色液中各組分理化性質(zhì)影響大, 而且也存在安全隱患。物理脫色法主要通過吸附作用完成, 因此對(duì)脫色液性質(zhì)影響小, 安全性高?；钚蕴课椒ㄊ且环N常用的物理脫色法, 具有吸附效果好、成本低, 且對(duì)樣品液影響小等優(yōu)點(diǎn), 因此廣泛被用于食品中蛋白液、糖漿、醬油等脫色處理(Sessaet al, 2008; 孫玉軍等, 2012; 周統(tǒng)武等, 2013;謝建華等, 2013; Miyagiet al, 2013)。在前期研究中,用酸法提取的魷魚皮膠原蛋白提取液為紅棕色, 本文選擇粉末活性炭為吸附劑, 研究吸附條件對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液脫色效果影響, 然后采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化活性炭吸附脫色條件, 并分析脫色后魷魚皮膠原蛋白提取液的蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成變化, 旨在為魷魚皮膠原蛋白的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

魷魚皮由浙江省舟山市富丹旅游食品有限公司提供; 粉末活性炭購于上海國藥化學(xué)試劑集團(tuán); 正丁醇(食用級(jí)); 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　主要儀器設(shè)備

CU420型電熱恒溫水浴鍋, 上海棱光技術(shù)有限公司; 721G型可見分光光度計(jì), 上海精密科學(xué)儀器有限公司; TGL-16C型高速離心機(jī), 上海安亭科學(xué)儀器廠; CH-420型電熱恒溫水槽, 上海一恒科技有限公司;L-8900型氨基酸分析儀, 日本日立公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1魷魚皮膠原蛋白提取液的制備冷凍保藏的魷魚皮先用流動(dòng)水解凍, 清洗干凈后切碎, 加入10%正丁醇浸沒魚皮, 4°C下萃取24 h除去脂類, 將脫脂的魚皮用蒸餾水沖洗干凈。根據(jù)魚皮質(zhì)量, 按照1︰6 (W:V)比例加入0.05 mol/L NaOH, 室溫浸泡60 min,充分溶脹魚皮后用蒸餾水洗至中性, 再按照魚皮質(zhì)量以1︰5 (W:V)比例加入0.5 mol/L冰醋酸, 勻漿,將勻漿液在 40°C恒溫水浴攪拌器中抽提 6 h, 然后4000 r/min離心20 min, 棄去不溶物, 得到顏色發(fā)紅的魷魚皮膠原蛋白提取液, 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于4°C 冷藏, 備用。

1.3.2魷魚皮膠原蛋白提取液中色素特征吸收波長魷魚皮膠原蛋白提取液呈紅棕色, 說明在可見光區(qū)有特征吸收。將魷魚皮膠原蛋白濃縮液用0.5 mol/L的冰醋酸適當(dāng)稀釋, 然后在400—800 nm進(jìn)行可見光譜掃描。

1.3.3活性炭吸附影響因素采用活性炭吸附法對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液進(jìn)行脫色, 在前期研究中發(fā)現(xiàn)粉末型活性炭對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液中色素吸附效果好于顆粒型活性炭。所以, 本研究采用粉末型活性炭為吸附劑, 分別研究活性炭添加量(1.0%—8.0%)、脫色時(shí)間(10—70 min)、溶液pH值(2.4—7.4)和脫色溫度(10—40°C)對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液脫色效果影響。

1.3.4活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白提取液色素條件優(yōu)化在研究活性炭對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除效果的基礎(chǔ)上, 選擇活性炭用量、膠原蛋白提取液pH值和脫色溫度進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析Box-Behnken中心組合試驗(yàn), 試驗(yàn)因素水平及編碼值見表1, 特征波長下膠原蛋白提取液色素的吸光值為響應(yīng)值, 采用Design Expert Software (version 7.1.4,USA)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行Quadratic模型擬合:

式中,y表示響應(yīng)值,Xi和Xj代表因素水平,β0、βj、βjj和βij分別表示常數(shù)項(xiàng)、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)系數(shù)。

1.3.5蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍(lán)法(Bradford,1976), 牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.6氨基酸組成分析取凍干樣品適量, 加入15 mL的6 mol/L HCl溶解, 在110°C下氮?dú)獗Ｗo(hù)水解22 h, 冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容。取1 mL水解液用55°C氮?dú)獯蹈? 加入1 mL蒸餾水再烘干,反復(fù) 3次, 再用 0.02 mol/L HCl溶解定容至 1 mL,0.45μm濾膜過濾, 取濾液 20μL上 L-8900型氨基酸分析儀測定。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=2),P＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1　魷魚皮膠原蛋白提取液色素特征吸收波長

如圖1所示, 魷魚皮膠原蛋白提取液在 400—450 nm有一個(gè)非常明顯的吸收峰, 經(jīng)測定確定魷魚皮膠原蛋白提取液中色素的特征吸收波長為420 nm(圖1b)。

圖1　魷魚皮膠原蛋白提取液可見吸光光譜Fig.1　The absorbance spectrum of collagen extract from squid skin

2.2　魷魚皮膠原蛋白提取液脫色條件

活性炭對(duì)色素類具有良好的吸附作用, 前期研究中發(fā)現(xiàn)粉末活性炭的脫色效果好于顆粒活性炭。所以采用粉末活性炭為吸附劑, 分別研究活性炭添加量、脫色時(shí)間、吸附pH值和脫色溫度對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除影響, 結(jié)果見圖2。

圖2　各因素對(duì)魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除影響Fig.2　Effects of each factor on the decoloring of collagen extract from squid skin

粉末活性炭具有多孔結(jié)構(gòu), 適當(dāng)?shù)丶哟蠡钚蕴坑昧磕芴岣邔?duì)色素的物理性吸附作用, 但是當(dāng)吸附達(dá)到飽和時(shí), 加大活性炭用量并不能有效提高色素的脫除效果(陳荔紅等, 2009)。從圖2a可以看出, 隨著活性炭用量的增加, 魷魚皮膠原蛋白液在 420 nm處吸光值逐漸地降低, 在活性炭添加量 4.0%時(shí)脫色液的吸光值最低。當(dāng)活性炭添加量大于5.2%時(shí), 脫色液的吸光值反而略有增加, 說明此時(shí)活性炭吸附已經(jīng)達(dá)到飽和, 而且添加過多粉末活性炭也不利于后續(xù)離心分離, 而脫色液中殘留的活性炭粉末會(huì)造成吸光值的增加。

由圖2b可知, 延長脫色時(shí)間有助于活性炭與色素分子的充分接觸, 從而提高吸附效果。當(dāng)脫色時(shí)間為 30 min時(shí), 魷魚皮膠原蛋白脫色液的吸光值最低, 而后增加脫色時(shí)間并沒有進(jìn)一步地提高脫色效果。

圖2c結(jié)果顯示, 在偏酸性pH值下, 活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液中色素效果好, 而在 pH值為 7.4時(shí), 脫色液在 420 nm處吸光值劇烈增加, 說明該條件下活性炭吸附色素能力急劇降低。

從圖2d可以看出, 脫色溫度在10—35°C時(shí), 活性炭的脫色效果隨著脫色溫度的升高而逐漸地增強(qiáng),說明活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液中色素應(yīng)是一個(gè)吸熱過程, 脫色溫度的提高有助于增加活性炭顆粒能量, 結(jié)果提高了與色素分子碰撞幾率, 從而提高脫色作用。此外, 適當(dāng)?shù)靥岣呶綔囟纫灿欣诮档汪滛~皮膠原蛋白液的黏度, 減少與活性炭分子間作用阻力, 有助于提高吸附作用。當(dāng)脫色溫度大于 35°C時(shí), 魷魚皮膠原蛋白脫色液在420 nm處吸光值又開始上升, 可能與色素在較高溫度下從活性炭上解吸有關(guān)(陳荔紅等, 2009)。

2.3　魷魚皮膠原蛋白提取液脫色工藝優(yōu)化

因?yàn)榛钚蕴繉?duì)氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等有吸附作用,而動(dòng)物蛋白色素常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起, 所以為了盡量降低蛋白質(zhì)損耗率, 吸附作用應(yīng)控制在短時(shí)內(nèi)完成。由圖2b結(jié)果可知, 脫色時(shí)間為30 min時(shí), 活性炭對(duì)魷魚皮膠原蛋白液的脫色作用基本完全, 所以選擇活性炭添加量、溶液pH值和脫色溫度做響應(yīng)面分析試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化脫色條件, 具體因素編碼值和實(shí)際值見表1, 試驗(yàn)安排和結(jié)果見表2。

表1　響應(yīng)面分析Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素編碼值和實(shí)際值Tab.1　Experimental code and corresponding real values in the Box-Behnken design of response surface method

表2　響應(yīng)面分析Box-Behnken中心組合試驗(yàn)安排和結(jié)果Tab.2　Experimental design and results of Box-Behnken response surface method

根據(jù)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行Quadratic回歸方差模型擬合, 得到活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白提取液中色素方程為:

對(duì)模型擬合結(jié)果進(jìn)行方差分析, 結(jié)果見表3。

表3方差分析結(jié)果顯示模型P值小于0.0001, 表明該模型極顯著(P＜0.01), 且相關(guān)系數(shù)R2= 0.9783,說明各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用 Quadratic模型進(jìn)行函數(shù)化, 實(shí)驗(yàn)確定的回歸方程能夠代替真實(shí)點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果。當(dāng)P＜0.05時(shí), 因素對(duì)結(jié)果影響顯著, 由此可以看出表3中各因素一次項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值均有顯著性影響。在脫色時(shí)間為30 min條件下, 表2數(shù)據(jù)經(jīng) Quadratic回歸模型擬合得到活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液色素最佳條件為: 活性炭添加量 4.2%, 膠原蛋白液 pH值 2.27, 脫色溫度35°C。魷魚皮膠原蛋白提取液在該條件下脫色后理論特征吸光值(OD420nm)為 0.854, 經(jīng)驗(yàn)證脫色后魷魚皮膠原蛋白液的實(shí)際特征吸光值為 0.839, 與理論值一致, 色素脫除率為45.6%。

活性炭添加量和pH值(x1x2)、活性炭添加量和脫色溫度(x1x3)和 pH 值和脫色溫度(x2x3)的交互作用與魷魚皮膠原蛋白液色素脫除效果關(guān)系, 結(jié)果見圖3。

從圖3a能夠看出, 魷魚皮膠原蛋白提取液中色素脫除效果總體趨勢是隨著活性炭添加量的增加而逐漸地增強(qiáng), 即: 420 nm下特征吸光值逐漸地降低。特別是在pH 2.6—2.0時(shí), 吸光值下降趨勢更為明顯,說明活性炭用量對(duì)提取液色素脫除具有線性影響。當(dāng)pH值3.0時(shí), 活性炭添加量對(duì)膠原蛋白液中色素脫除效果影響平緩。而且粉末活性炭添加量過大時(shí), 有一些粉末活性炭會(huì)漂浮在提取液表面, 后面的離心處理也很難再除去, 所以未考查活性炭添加量大于4.8%時(shí)對(duì)膠原蛋白液的脫色效果。

圖3b顯示, 在相對(duì)較低脫色溫度25°C時(shí), 活性炭添加量的加大對(duì)膠原蛋白液色素的脫除影響不明顯, 表現(xiàn)為膠原蛋白液吸光值變化平緩。同樣, 當(dāng)活性炭添加量較低時(shí), 如: 3.6%, 脫色溫度對(duì)膠原蛋白液中色素脫除影響平緩。而當(dāng)活性炭添加量為 4.8%時(shí), 魷魚皮膠原蛋白液色素的脫除隨著脫色溫度的升高而增強(qiáng)。由此可以判定活性炭添加量和脫色溫度在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的較高水平時(shí)對(duì)膠原蛋白液色素脫除影響顯著, 因脫色溫度大于 35°C不利于魷魚皮膠原蛋白液色素的脫除(見圖2d結(jié)果), 所以圖3b未考查脫色溫度大于35°C情況。

由圖3c可知, 魷魚皮膠原蛋白液的pH值為2.4—3.0時(shí), 提高脫色溫度有利于活性炭吸附色素, 但當(dāng) pH值小于 2.4時(shí), 脫色溫度對(duì)膠原蛋白提取液色素的脫除影響比較平緩。

2.4　蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成分析

測定優(yōu)化條件下活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液色素后蛋白質(zhì)含量, 分析氨基酸組成變化, 未脫色樣品為對(duì)照, 具體結(jié)果分別見圖4和表4。

圖4　魷魚皮膠原蛋白提取液的蛋白質(zhì)含量變化Fig.4　Changes in protein content of collagen extract from squid skin

活性炭對(duì)色素類物質(zhì)的吸附具有非特異性, 在吸附色素時(shí), 溶液中蛋白質(zhì)、肽以及氨基酸類也同時(shí)被吸附(Sessaet al, 2008)。徐曼等(2013)用粉末活性炭對(duì)豆粕蛋白酶解液進(jìn)行脫色處理, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)最優(yōu)脫色條件下(溶液 pH 4.0, 粉末活性炭用量 0.6%, 脫色溫度 50°C, 吸附時(shí)間 50min), 豆粕蛋白酶解液肽的損失率為24.96%。章紹兵等(2011)報(bào)道粉末活性炭對(duì)花生蛋白酶解液脫色(溶液 pH 3.2, 活性炭用量 8%,吸附溫度55°C, 吸附時(shí)間30min)后蛋白損失20.86%。上述文獻(xiàn)報(bào)道雖然活性炭吸附條件不同, 但是脫色液中蛋白質(zhì)及肽類損耗在20%左右。圖4中魷魚皮膠原蛋白液的蛋白質(zhì)含量由脫色前 890.26μg/mL降至脫色后715.27μg/mL (P＜0.05), 蛋白質(zhì)損失率為19.65%, 與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

由表4氨基酸分析結(jié)果可知, 魷魚皮膠原蛋白提取液的氨基酸總量由脫色前765.72 mg/g降至脫色后590.16 mg/g, 損耗率為22.93%, 略高于圖4蛋白質(zhì)損耗率。甘氨酸含量無論是脫色前(175.67 mg/mL,22.94%)還是脫色后(136.02 mg/g, 23.05%)均最高, 谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸含量也較高, 而酪氨酸和組氨酸含量較低, 符合水產(chǎn)膠原蛋白氨基酸和I型膠原蛋白氨基酸特點(diǎn)(李八方等, 2013; 侯虎等,2013; 夏珊珊等, 2014)。此外, 魷魚皮膠原蛋白液中蛋氨酸和半胱氨酸總量不到 1%, 與膠原蛋白幾乎不含有含硫氨基酸報(bào)道一致(李八方等, 2013)。表4結(jié)果顯示活性炭脫色后, 魷魚皮膠原蛋白提取液的半胱氨酸含量增加了一倍, 應(yīng)與酸性條件下活性炭吸附促進(jìn)蛋氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸有關(guān)。脫色液中一些氨基酸, 如: 異亮氨酸、天冬氨酸、組氨酸、亮氨酸和賴氨酸的損耗率要高于其它氨基酸, 可能與活性炭吸附的蛋白質(zhì)或色素蛋白中這幾種氨基酸含量相對(duì)較高, 或者與活性炭直接吸附這些游離氨基酸有關(guān)。

表4　魷魚皮膠原蛋白提取液的氨基酸組成分析Tab.4　Amino acid analysis for collagen extract from squid skin

3　結(jié)論

活性炭吸附法能有效減少魷魚皮膠原蛋白提取液的色素值, 當(dāng)脫色時(shí)間為30 min時(shí), 經(jīng)響應(yīng)面分析得到活性炭最佳脫色條件為: 活性炭添加量 4.2%,溶液pH 2.27, 脫色溫度35°C。在最優(yōu)條件下, 魷魚皮膠原蛋白提取液的脫色率為45.6%, 蛋白質(zhì)和氨基酸損耗率在20%左右。氨基酸分析顯示脫色后的魷魚皮膠原蛋白具有水產(chǎn)膠原蛋白氨基酸和I型膠原蛋白氨基酸特點(diǎn)。但是, 如何利用被活性炭吸附的蛋白質(zhì)或氨基酸, 還有待進(jìn)一步深入研究。

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