王克強(qiáng)，陶 琳，王緒淮

(萊蕪市婦幼保健院，山東萊蕪 271199)

中藥復(fù)方對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其抑制血管新生機(jī)制初步探討

王克強(qiáng)，陶 琳，王緒淮

(萊蕪市婦幼保健院，山東萊蕪 271199)

目的:觀察中藥復(fù)方肺金生方對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)和對(duì)新生血管的影響，初步闡明其可能的作用機(jī)制。方法:選取成功構(gòu)建Lewis肺癌移植瘤模型C57BL/6小鼠48只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為荷瘤對(duì)照組、順鉑組、肺金生方低劑量組、肺金生方高劑量組4組，每組12只，分別以相應(yīng)藥物干預(yù)2周，取瘤塊稱重，計(jì)算腫瘤抑制率;采用SABC免疫組化法檢測(cè)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的微血管密度(MVD);采用western blot法檢測(cè)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白和堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)。結(jié)果:各組腫瘤質(zhì)量中，順鉑組(1.65±0.15)g、肺金生方低劑量組(2.42±0.19)g、高劑量組(1.83± 0.16)g與荷瘤對(duì)照組(3.13±0.21)g比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤的抑瘤率分別為:荷瘤對(duì)照組0，順鉑組46.61%，肺金生方低劑量組27.32%，肺金生方高劑量組44.29%;各組MVD的值中，順鉑組(16.74±0.96)個(gè)，肺金生方低劑量組(19.31±0.85)個(gè)、肺金生方高劑量組(17.21±0.77)個(gè)與荷瘤對(duì)照組(29.98±1.06)個(gè)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western blot結(jié)果顯示，各治療組的VEGF和bFGF蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達(dá)與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:肺金生方可抑制血管新生對(duì)抗Lewis肺癌，其機(jī)制可能與抑制VEGF和bFGF相關(guān)。

中藥復(fù)方肺金生方;Lewis肺癌;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

肺癌尤其是原發(fā)性支氣管肺癌(Primary lung cancer)已經(jīng)成為全球常見的惡性腫瘤之一。研究表明，我國(guó)肺癌的病死率在近30年內(nèi)已經(jīng)上升至46.5%，居于惡性腫瘤死亡原因的首位［1］。血管新生(angiogenesis)在機(jī)體的多種生理和病理過程中都起著至關(guān)重要的作用。肺癌作為常見的惡性腫瘤，血管新生同樣是該實(shí)體瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的決定性因素，因此抗血管新生成是臨床上治療肺癌的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。肺金生方是由《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯與現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合轉(zhuǎn)化而成的新方，其用于臨床治療肺癌療效相當(dāng)顯著。盡管近年來對(duì)于肺金生方在臨床療效上的報(bào)道逐漸增多，但對(duì)其治療肺癌的作用機(jī)制研究極為少見。本研究采用C57BL/6小鼠構(gòu)建Lewis肺癌移植瘤模型，觀察中藥復(fù)方肺金生方對(duì)其腫瘤生長(zhǎng)和抑制率的影響，探究血管新生的相關(guān)指標(biāo)微血管密度(MVD)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白和堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)情況，以此探討肺金生方對(duì)肺癌治療的可能作用機(jī)制，以求為肺金生方的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

肺金生方由澤漆30 g、前胡10 g、人參、桂枝各9 g、紅豆杉枝8 g、蜂房15 g、石見穿30 g等組成，參照文獻(xiàn)［2］肺金生方低、高劑量分別相當(dāng)于臨床成人用量的5、20倍，常規(guī)水煎濃縮成0.925、3.7 g/mL。滅菌后于4℃冰箱備用;順鉑20 mg/瓶，齊魯制藥廠(生產(chǎn)批號(hào)017023);達(dá)爾伯克氏培養(yǎng)基(DMEM):美國(guó) Gibco BRL公司;胎牛血清(FBS):美國(guó)Hyclone公司;一抗:MVD、VEGF、bFGF和β-actin均購(gòu)自美國(guó) Santa cruz生物技術(shù)公司;電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)公司;其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

50只健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)SCKK(滬)2007-0005)。Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自上海醫(yī)藥工程研究院。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

MCO-175型CO2培養(yǎng)箱:日本SANYO公司; SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)安泰公司; Olympus CKX41型倒置顯微鏡:日本Olympus公司; Gel DOC XR凝膠成像分析系統(tǒng):美國(guó)Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)

將Lewis肺癌細(xì)胞株接種于培養(yǎng)瓶中，采用DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化傳代。

2.2 C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型建立及分組處理

取對(duì)數(shù)期Lewis肺癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度 1×107個(gè)/mL，于 20 min內(nèi)每只C57BL/6小鼠右上肢腋窩皮下接種隔日觀察。接種5 d后待移植瘤長(zhǎng)至直徑0.3～0.5 cm時(shí)，選取荷瘤成功的小鼠48只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為荷瘤對(duì)照組、順鉑組，肺金生方低劑量組、肺金生方高劑量組每組各12只。接種5 d后晨起空腹給藥，荷瘤對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;順鉑組于開始給藥的第1、3、5天尾靜脈給予順鉑注射液1 mL(含順鉑0.1 mg)，同時(shí)給予0.9 %氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，每日1次，共2周;肺金生方低、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的肺金生方0.4 mL灌胃，每日1次，共2周。

2.3 肺金生方的腫瘤抑制率計(jì)算

灌胃14 d后動(dòng)物禁食不禁水12 h，脫頸處死后剝?nèi)×鰤K，完整剝?nèi)∫父C皮下腫瘤，去除血污脂肪等，電子天平稱取瘤質(zhì)量。按照公式:抑瘤率=(1－用藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%，計(jì)算腫瘤抑制率。

2.4 C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤微血管密度(MVD)檢測(cè)

采用 SABC免疫組化方法，結(jié)果判定采用Weidner改進(jìn)方法［3］。選擇最密集的5個(gè)微血管標(biāo)記區(qū)，記錄5個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù) ，取其均數(shù)為MVD的值。

2.5 Western blot法檢測(cè)VEGF、dFGF蛋白表達(dá)情況

隨機(jī)取出凍存的腫瘤組織，于液氮中迅速研磨加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，置4℃、12 000 g離心15 min取上清，BCA蛋白定量后，40 μg蛋白15%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。5% 脫脂奶粉封閉4 h，一抗(VEGF、dFGF 1∶1 000)4℃過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1∶50 000)溫育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL試劑曝光，凝膠成像分析目標(biāo)蛋白條帶灰度值并進(jìn)行比較。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

給藥2周后，各組C57BL/6小鼠均成活。荷瘤對(duì)照組小鼠活動(dòng)明顯減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)不明顯，每日進(jìn)食量減少，皮膚光澤不強(qiáng)。肺金生方低劑量組小鼠活動(dòng)尚可，每日進(jìn)食量尚可，皮膚光澤尚可。順鉑組和肺金生方高劑量組小鼠活動(dòng)尚可，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，每日進(jìn)食量尚可，皮膚光澤度明顯優(yōu)于其他組，提示肺金生方高劑量組小鼠與順鉑組小鼠生活質(zhì)量?jī)?yōu)于其他組。

3.2 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠的腫瘤抑制率的影響

表1顯示，造模后各組均生成腫瘤，各組灌胃給藥14 d，脫頸處死后取瘤稱重結(jié)果，各組腫瘤質(zhì)量為荷瘤對(duì)照組(3.13±0.21)g、順鉑組(1.65±0.15) g、肺金生方低劑量組(2.42±0.19)g、肺金生方高劑量組(1.83±0.16)g。順鉑組、肺金生方低、高劑量組與荷瘤對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，肺金生方高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各組對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤的抑瘤率分別為荷瘤對(duì)照組0，順鉑組46.61%，肺金生方低劑量組27.32%，肺金生方高劑量組44.29 %。

表1 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠腫瘤抑制率影響(±s)

表1 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠腫瘤抑制率影響(±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)量(只)瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(%) 44.29 12 3.13±0.21 0順 鉑 組 12 1.65±0.15＊＊ 46.61肺金生方低劑量組 12 2.42±0.19＊＊ 27.32肺金生方高劑量組 12 1.83±0.16＊＊荷 瘤 對(duì) 照 組

3.3 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的影響

表2顯示，采用 SABC免疫組化方法，各組MVD值分別為荷瘤對(duì)照組(29.98±1.06)個(gè)，順鉑組(16.74±0.96)個(gè)，肺金生方低劑量組(19.31± 0.85)個(gè)，肺金生方高劑量組(17.21±0.77)個(gè);順鉑組、肺金生方低、高劑量組與荷瘤對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影響(±s)

表2 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD影響(±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)量/只 平均MVD/個(gè)12 29.98±1.06順 鉑 組 12 16.74±0.96＊＊肺金生方低劑量組 12 19.31±0.85＊＊肺金生方高劑量組 12 17.21±0.77荷 瘤 對(duì) 照 組＊＊

3.4 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響

表3圖1顯示，經(jīng)Western blot法檢測(cè)后，順鉑和肺金生方低劑量、高劑量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表達(dá);肺金生方低劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達(dá)量與荷瘤模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);順鉑組和肺金生方高劑量組的VEGF和bFGF蛋白表達(dá)量與荷瘤模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達(dá)與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

4 討論

目前，肺癌已成為國(guó)內(nèi)外最為常見的惡性腫瘤之一，而臨床上對(duì)于肺癌的治療除手術(shù)切除病灶以外，術(shù)后采用放化療是最為常見的輔助治療方法，但治療效果并不盡如人意［4］。肺癌尤其是原發(fā)性肺癌的發(fā)病率逐漸升高，因此在治療上迫切需要藥物的不斷更新和新藥的臨床應(yīng)用。我國(guó)是中醫(yī)大國(guó)，從中醫(yī)角度分析，肺癌患者肺組織中積塊的產(chǎn)生是與正氣虧虛、邪毒入侵、氣機(jī)不利、氣血痰搏結(jié)有關(guān)［5］，因此降氣消痰為治療良方。肺金生方來源于《金匱要略》經(jīng)典方澤漆湯，方中以澤漆為君，功專消痰行水，人參助澤漆逐水消痰、扶正固本;桂枝、前胡、生姜溫陽(yáng)化飲、降氣消痰;人參、甘草健脾以扶正氣，佐黃芩以清泄水飲久留所化之郁熱，加用蜂房、紅豆杉散結(jié)消腫，共奏補(bǔ)肺散結(jié)、化氣消痰、止咳平喘之功［6］。該方已被用作肺虛痰阻型非小細(xì)胞肺癌的臨床治療方。龐德湘等［2］研究發(fā)現(xiàn)，該方可以抑制Lewis肺癌小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移，但對(duì)于肺癌發(fā)生發(fā)展的另一個(gè)重要因素血管新生的影響并沒有做深入探討，為此本研究從該靶點(diǎn)出發(fā)進(jìn)行研究。

表3 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響(±s)

表3 肺金生方對(duì)C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響(±s)

注:與荷瘤對(duì)照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)量/只 灰度值荷 瘤 對(duì) 照 組VEGF灰度值/ β-actin灰度值bFGF灰度值/ β-actin 12 0.889±0.021 1.013±0.062順 鉑 組 12 0.482±0.043＊＊0.591±0.037＊＊肺金生方低劑量組 12 0.729±0.045* 0.893±0.021*肺金生方高劑量組 12 0.513±0.017＊＊0.615±0.034＊＊

自1971年美國(guó)Folkman系統(tǒng)地提出了腫瘤血管生成的假說，認(rèn)為實(shí)體瘤在2～3mm3時(shí)沒有新生的血管，若實(shí)體瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，就需要血管的保障來供應(yīng)增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此抑制血管新生成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)［7］。新生血管的生成是實(shí)體瘤細(xì)胞增殖的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微血管密度( Microvascular density，MVD)增加后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力會(huì)隨之提升，且腫瘤的惡性潛能也會(huì)隨之加大［8］。因此，MVD可以作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物，在腫瘤血管生成的評(píng)估中，可以衡量血管生成的活性，還可以檢測(cè)血管生成的強(qiáng)度，也可以作為一個(gè)穩(wěn)定的評(píng)價(jià)指標(biāo)來評(píng)估抗腫瘤血管生成藥物的治療效果。本研究結(jié)果顯示，肺金生方低劑量和高劑量均能降低C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤M VD的數(shù)量，與荷瘤對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Folkman還指出，血管新生過程涉及到血管生成因子與血管生成抑制因子之間的平衡，一旦失衡將會(huì)嚴(yán)重影響血管的生成，這一過程還涉及到促血管生成因子的分泌以及內(nèi)源性血管生成抑制因子產(chǎn)生的相應(yīng)減少［7］。目前，已知血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是最重要的血管生長(zhǎng)刺激因子［9-10］。VEGF作為促血管內(nèi)皮增殖的細(xì)胞調(diào)控因子，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，促內(nèi)皮增殖促血管生成，是目前所知作用最強(qiáng)的和特異性最高且與血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)有1/5的同源性，幾乎在所有人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá)［11］。bFGF可促進(jìn)內(nèi)皮中胚層或外胚層來源的細(xì)胞有絲分裂過程，是一種強(qiáng)有力的血管生成誘導(dǎo)因子。由于組織和細(xì)胞的差異，不同的bFGF亞型表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，在大部分非小細(xì)胞肺癌中均能檢測(cè)到bFGF的高表達(dá)，說明bFGF與腫瘤疾病的發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)［12］。另外，bFGF還與VEGF有協(xié)同作用，兩者與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合后，可通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)到通路促進(jìn)新的血管生成［13］。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，順鉑和肺金生方低劑量、高劑量均能抑制C57BL/6荷瘤小鼠移植瘤VEGF和bFGF蛋白的表達(dá);肺金生方低劑量組VEGF和bFGF蛋白的表達(dá)量與荷瘤模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);順鉑組和肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達(dá)量與荷瘤模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);肺金生方高劑量組VEGF和bFGF蛋白表達(dá)與順鉑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此我們認(rèn)為，肺金生方可以通過抑制VEGF、bFGF等表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制Lewis腫瘤血管生成的作用，進(jìn)而達(dá)到抑制 Lewis肺癌的效用。但中藥的組成和合成是個(gè)復(fù)雜的多因素過程，其抗腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制也是多靶點(diǎn)、多通路的，因此我們需要進(jìn)一步研究、確定肺金生方對(duì)腫瘤血管新生抑制作用的具體特異性有效靶點(diǎn)。

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Inhibitory Effect of Chinese Herbal Compound on Lewis Lung Cancer in Mice and Its Inhibition of Angiogenesis Mechanism

WANG Ke-qiang，TAO Lin，WANG Xu-huai
(Laiwu City，MCH，Shandong Laiwu 271199，China)

Objective:To observe the effects of traditional Chinese medicine compound lung Jinsheng prescription to the Lewis lung cancer tumor growth and angiogenesis in mice，preliminary to elucidate its possible mechanism.Methods: Lewis lung tumor was successfully constructed model C57BL/6 48 mice were randomly divided into 4 groups:control group，tumor-bearing，cisplatin group，lungs UBUKATA low dose group，high dose lung Jinsheng groups，each group had 12 mices.Respectively corresponding drug intervention two weeks，the tumor was weighed to calculate the tumor inhibition rate;western blot assay using mice with Lewis lung tumor tissue;using SABC immunohistochemical assay mice with Lewis lung tumor microvessel density(MVD)vascular endothelial growth factor(VEGF)and basic fibroblast protein growth factor(bFGF)expression.Results:The tumor mass in each group，cisplatin group(1.65±0.15 g)，lung Jinsheng low dosage(2.42±0.19 g)，high-dose group(1.83±0.16 g)and tumor-bearing control group(3.13±0.21 g)were statistically significant compared;inhibition rate of each group of mice with Lewis lung tumors were:tumor-bearing control group 0，cisplatin group 46.61%，lung Jinsheng low dosage group 27.32% ，44.29%of lung Jinsheng high dose group; MVD values in each group，cisplatin group(16.74±0.96 unit)，lung Jinsheng prescription low dose group(19.31± 0.85 unit)，lung Jinsheng high dose group(17.21±0.77 unit)and tumor-bearing control group(29.98±1.06 unit) were statistically significant compared with;Western blot showed that the expression of VEGF and bFGF treatment group were lower than the model group protein，the difference was statistically significant;lung Jinsheng high dose groups of VEGF and bFGF protein expression compared with cisplatin group，the difference was not statistically significant.Conclusion:Pulmonary Jinsheng only inhibit angiogenesis against Lewis lung carcinoma，which may be associated with inhibition of VEGF and bFGF.

Traditional Chinese medicine lung Jinsheng party;Lewis lung carcinoma;Vascular endothelial growth factor;Basic fibroblast growth factor

R285.5

B

1006-3250(2015)06-0671-04

2015-03-09

王克強(qiáng)，主管藥師，醫(yī)學(xué)本科，從事中醫(yī)藥的實(shí)驗(yàn)與研究。