肺金生方抗非小細胞肺癌EGFR-TKIs 耐藥性的分子機制研究

姚 成 高文倉

原發(fā)性肺癌（以下簡稱肺癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)國家癌癥中心2018 年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2014 年我國肺癌發(fā)病率約78.1 萬，在男性惡性腫瘤居第1 位，女性惡性腫瘤第2 位[1]。而非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的85%[2]。人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為肺癌最常見的致病突變。靶向EGFR 的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）是目前臨床治療EGFR 致病突變NSCLC 患者的一線藥物，在改善晚期NSCLC 患者總生存期和無進展生存期方面有突出作用[3]。然而EGFR-TKIs 同樣存在耐藥現(xiàn)象，臨床上EGFR 基因突變的晚期NSCLC 在EGFR-TKIs 一線治療約10個月后，通常會因獲得性耐藥而出現(xiàn)疾病進展[4]。在獲得性耐藥機制中，EGFR T790M 突變和酪氨酸蛋白激酶Met（c-MET）基因擴增占主要地位。Wang 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs 獲得性耐藥約20%是由c-MET 基因擴增及下游蛋白激酶B（AKT）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）激活引起的。因此，c-MET 是繼EGFR、ALK 之后NSCLC 的又一分子治療靶點。中醫(yī)藥是我國腫瘤治療的重要手段之一。臨床研究顯示，中藥配合EGFR-TKIs 治療肺癌，能一定程度延長患者疾病無進展生存期[6-7]。肺金生方《金匱要略》以澤漆湯為基礎，方中多種中藥成分均有抗腫瘤作用[8-10]。本研究探討肺金生方抗非小細胞肺癌EGFRTKIs 耐藥性作用及分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物 BALB/c 裸鼠（SPF 級），雄性，6 周齡，20～25g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007—0005。本實驗研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院動物實驗倫理審核通過（批準編號：SYXK（浙）2018-0012）。

1.2 細胞株 人非小細胞肺癌HCC827 細胞株購自上海生命科學院細胞庫（目錄號SCSP-538）。

1.3 藥物 肺金生方由澤漆、石見穿各30g，前胡10g，人參、桂枝、黃芩、半夏各9g，紅豆杉8g，蜂房15g，生姜5g 組成，由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房配置。加水浸泡30min 后，按湯劑常規(guī)方法煎熬，過濾并濃縮成含生藥0.536g/mL 的藥液，冷卻后4℃保存。按照“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出裸鼠等效劑量，設置藥物濃度為53.6g/kg。吉非替尼（商品名：易瑞沙，規(guī)格：0.25g，批號 701144）阿斯利康公司生產(chǎn)，加入0.9%注射用水，配置成1mg/mL 的吉非替尼混懸液。

1.4 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號12 633012）、0.25%胰酶（批號25 300054）、胎牛血清（批號10099），購自GIBCO 公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（批號 556420），購自美國BD 公司；p-EGFR 單抗（批號ab40815），EGFR 單抗（批號ab40815），p-c-MET 單抗（批號ab5662），c-MET 單抗（批號ab 252205）抗體，購自美國abcam 公司；p-AKT 單抗（批號4060S），AKT 單抗（批號4685S），p-ERK 單抗（批號4370S），ERK 單抗（批號4695S）抗體，CST 公司；GAPDH 抗體，購自華安生物技術(shù)有限公司。

1.5 儀器 生物安全柜，-80℃超低溫冰箱，細胞培養(yǎng)箱，液氮罐，Thermo fisher；SynergyMx M5 全波段多功能酶標儀，Molecular Devices；金屬浴，杭州奧仟科技有限公司；低溫超速離心機，Eppendorf；細胞計數(shù)儀Countstar，上海睿鈺生物科技有限公司；ACEA NovoCyteTM 系列流式細胞儀，ACEA Biosciences；CFX-Touch 96 熒光定量PCR 儀，美國伯樂公司；Odyssey 紅外激光雙色圖像分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1 中藥復方制備 將肺金生方藥液在50℃煎煮2～5h，使1g 溶液含有5g 生藥，冷凍干燥成粉。用0.9%生理鹽水溶解，使用前離心5000 r/min，10min，0.22μm 微孔濾膜過濾，調(diào)節(jié)PH 值，制成體外細胞培養(yǎng)用的中藥原液，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 構(gòu)建非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株 人NSCLC 細胞株HCC827 接種于6 孔板中，在培養(yǎng)基中按0、0.001、0.01、0.1、1.0、10 和100μM 濃度梯度加入吉非替尼，以誘導篩選吉非替尼耐藥細胞株。后續(xù)使用濃度為1.00μM 的吉非替尼維持細胞耐藥性。CCK8 法檢測正常HCC827 細胞株和耐藥HCC827 GR 細胞株的IC50，應用熒光定量PCR 法檢測c-MET 擴增效率。

2.3 構(gòu)建皮下移植瘤模型 消化構(gòu)建成功的吉非替尼耐藥細胞株接種皮下移植瘤，以每只4×107/200μL注射后肢皮下。采用隨機數(shù)字表法將20 只BALB/c裸鼠隨機分成四組：空白對照組、吉非替尼組、肺金生方組和肺金生方+吉非替尼組，每組5 只。空白對照組給予生理鹽水125μL 腹腔注射；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及生理鹽水125μL 腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及生理鹽水125μL 腹腔注射；肺金生方+吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃給藥，并生理鹽水125μL 腹腔注射。給藥頻次設置為每2 天1 次，連續(xù)給藥4 周。4 周后取出皮下移植瘤進行稱重拍照。

2.4 CCK8 檢測肺金生方和吉非替尼對耐藥HCC827 GR 細胞增殖的作用 設置四組：空白對照組以完全培養(yǎng)液（RPMI-1640 培養(yǎng)液+10%胎牛血清）正常培養(yǎng)；吉非替尼組用完全培養(yǎng)液+終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用完全培養(yǎng)基+肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用完全培養(yǎng)基+吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。培養(yǎng)48h 后，加入10μL CCK8 孵育2h 后，檢測450nm 波長處吸光度值。

2.5 流式細胞儀檢測肺金生方和吉非替尼對HCC827 GR 耐藥細胞的作用 將HCC827 GR 細胞鋪板于6 孔板中，設置四組：空白對照組用正常培養(yǎng)；吉非替尼組用終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。培養(yǎng)24h 后，消化貼壁的細胞。調(diào)整細胞濃度為1×106，應用Annexin V-FITC（30μg/mL）/PI 染色后迅速上機檢測。

2.6 Western Blot 檢測吉非替尼和肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK 的作用 設置四組：空白對照組正常培養(yǎng)；吉非替尼組用終濃度為1μM 的吉非替尼；肺金生方組用肺金生方1mg/mL；肺金生方+吉非替尼組用吉非替尼1μM+肺金生方1mg/mL。用含0.1% FBS 的1640 饑餓培養(yǎng)基和對應的藥物饑餓過夜，次日同時加入EGF（10ng/mL）和HGF（10ng/mL）刺激10min，檢測EGFR、磷酸化EGFR（p-EGFR）、MET、磷酸化MET（p-MET）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、ERK1/2、磷酸化ERK（p-ERK1/2）蛋白水平，GAPDH 作為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差采用方差分析和t 檢驗，P＜0.05 表示差異均有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 構(gòu)建非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株 CCK8檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，吉非替尼誘導的耐藥細胞株HCC827 GR 的細胞活力在吉非替尼濃度達到0.10、1.0μM 時明顯高于正常HCC827 細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01），同時吉非替尼在1.0μM時對正常HCC827 細胞具有明顯的殺傷作用，但是對耐藥細胞株HCC827 GR 的抑制作用明顯降低，后續(xù)將使用濃度為1.0μM 的吉非替尼維持細胞耐藥性。同時對正常和耐藥HCC827 細胞株c-MET 表達水平進行mRNA 水平的鑒定，結(jié)果顯示，耐藥細胞株HCC827 GR 的c-MET 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示HCC827 吉非替尼耐藥細胞株構(gòu)建成功，同時該細胞株具有明顯的c-MET 擴增。見表1-2。

表1 各組吉非替尼處理后細胞活力比較（%，±s）

表1 各組吉非替尼處理后細胞活力比較（%，±s）

注：HCC827 組為人非小細胞肺癌對照組；HCC827GR 組為人非小細胞肺癌耐藥組；與HCC827 組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 各組吉非替尼處理后c-MET mRNA 相對表達水平比較（±s）

表2 各組吉非替尼處理后c-MET mRNA 相對表達水平比較（±s）

注：HCC827 組為人非小細胞肺癌對照組；HCC827GR 組為人非小細胞肺癌耐藥組；與HCC827 組比較，aP＜0.01

3.2 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞皮下移植瘤的作用 與空白對照組比較，吉非替尼組小鼠皮下移植瘤瘤重無差異（P＞0.05），肺金生方處理組小鼠皮下移植瘤瘤重減輕，吉非替尼+肺金生方組小鼠皮下移植瘤重明顯小于吉非替尼組及肺金生方組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3、圖1。

表3 各組小鼠皮下移植瘤瘤重比較（g，±s）

表3 各組小鼠皮下移植瘤瘤重比較（g，±s）

注：空白對照組給予0.9%生理鹽水腹腔注射；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及生理鹽水腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及生理鹽水腹腔注射；吉非替尼+肺金生方組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃，并生理鹽水腹腔注射；與空白對照組比較，aP＜0.01；與吉非替尼組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與肺金生方組比較，cP＜0.01

3.3 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞增殖的影響 與空白對照組比較，肺金生方組和吉非替尼+肺金生方組明顯降低耐藥HCC827 GR 細胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01）。增殖能力：吉非替尼+肺金生方組＜肺金生方組＜吉非替尼組＜對照組。見表4。

3.4 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞早期凋亡的影響 與空白對照組比較，吉非替尼組、肺金生方組以及吉非替尼+肺金生方組細胞的凋亡明顯增加。凋亡率：空白對照組（3.05±0.54）%＜吉非替尼組（7.38±0.45）%＜肺金生方組（7.40±0.56）%＜吉非替尼+肺金生方組（12.80±0.72）%。見圖2。

表4 各組細胞增殖率比較（%，±s）

表4 各組細胞增殖率比較（%，±s）

注：空白對照組給予腹腔注射0.9%生理鹽水；吉非替尼組給予吉非替尼50mg/kg 灌胃及0.9%生理鹽水腹腔注射；肺金生方組給予肺金生方劑量53.6g/kg 灌胃及0.9%生理鹽水腹腔注射；吉非替尼+肺金生方組給予吉非替尼50mg/kg+肺金生方劑量53.6g/kg 聯(lián)合灌胃，并生理鹽水腹腔注射；與空白對照組比較，aP＜0.01；與吉非替尼組比較，bP＜0.01

3.5 吉非替尼聯(lián)用肺金生方對耐藥HCC827 GR 細胞p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK 的作用 與空白對照組比較，吉非替尼組略微降低EGFR 磷酸化信號，但是并不能明顯影響p-c-MET 以及下游信號p-AKT/p-ERK1/2 信號。肺金生方組和吉非替尼+肺金生方組c-MET 和p-c-MET 的水平明顯降低，同時下游p-AKT/p-ERK1/2 水平也明顯降低。GAPDH 作為內(nèi)參。見圖3。

圖1 肺金生方聯(lián)用吉非替尼對吉非替尼耐藥皮下移植瘤的作用

圖2 肺金生方聯(lián)用吉非替尼對耐藥細胞早期凋亡的影響

圖3 藥物聯(lián)用對耐藥細胞株p-EGFR/p-MET/p-AKT/p-ERK1/2 的作用

4 討論

盡管通過引入EGFR-TKIs 治療晚期NSCLC EGFR 基因突變患者的臨床結(jié)果有所改善，但是由于內(nèi)在或獲得性耐藥的發(fā)生，預后仍然較差。研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-MET 信號通路的異常激活是EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥的一個重要原因，約占NSCLC 患者中EGFR-TKIs 獲得性耐藥的20%[11-13]。肺金生方的多種主要組分在抗腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[14-17]。而目前關于肺金生方方劑抗EGFR-TKIs 耐藥的研究尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，誘導耐藥株存在明顯的c-MET 擴增。本研究結(jié)果還顯示吉非替尼組皮下移植瘤和空白對照組比較無明顯減輕，說明該移植瘤確實產(chǎn)生了吉非替尼耐藥。肺金生方組移植瘤瘤重明顯較空白對照組減輕，證明肺金生方能夠抑制吉非替尼耐藥的皮下移植瘤的生長。吉非替尼+肺金生方組皮下移植瘤瘤重明顯較空白對照組和吉非替尼組減輕，再次說明肺金生方能逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的表型。體外實驗結(jié)果顯示，肺金生方和吉非替尼聯(lián)用明顯抑制吉非替尼耐藥誘導的細胞增殖，并誘導細胞凋亡。HGF/c-MET 誘導EGFR-TKIs 獲得性耐藥的分子機制為c-MET 擴增與異?；罨?，以及下游AKT和ERK1/2 磷酸化。本研究結(jié)果顯示，肺金生方能明顯抑制吉非替尼耐藥導致的c-MET 擴增以及下游AKT 和ERK1/2 的磷酸化，兩藥聯(lián)用后效果更明顯。肺金生方可能通過抑制HGF 受體c-MET 蛋白表達及活化，從而抑制HGF/c-MET 信號通路的異常激活誘導的吉非替尼耐藥。