茯苓最佳炮制工藝的綜合評分法研究

王海燕 楊俊杰 梁利香

（信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南信陽464000）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria Cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心之功效，可用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠[1]。茯苓為常用中藥，是多種方藥及中成藥的原料，有“十藥九茯苓”之說。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、樹膠、蛋白質(zhì)以及脂肪酸等[2]?！吨袊幍洹穂1]（2010 年版一部）茯苓項(xiàng)下收載的加工方法為：“挖出后除去泥沙，堆置‘發(fā)汗’后，攤開晾至表面干燥，再‘發(fā)汗’，反復(fù)數(shù)次至現(xiàn)皺紋，內(nèi)部水分大部散失后，陰干”；炮制方法為：“取茯苓個(gè)，浸泡，洗凈，潤后稍蒸，及時(shí)削去外皮，切制成塊或切厚片，曬干”。此方法加工生產(chǎn)流程繁瑣，影響有效成分含量，“陰干”后再“浸泡”、“潤蒸”，造成能源浪費(fèi)。故我們在調(diào)查了多個(gè)茯苓產(chǎn)地和加工企業(yè)的加工方法后，將其生產(chǎn)工藝簡化為：發(fā)汗→去皮→切制→干燥，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，首次以茯苓酸和茯苓多糖的綜合作用為指標(biāo)，對茯苓的炮制方法進(jìn)行研究，以期為茯苓飲片的生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料與試劑 茯苓藥材購于信陽市藥材站，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院周巍教授鑒定為Poria Cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；茯苓酸對照品為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)面積歸一化法測定其純度大于98%；D-無水葡萄糖對照品由中國藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，供含量測定用，批號110833-200503；純化水自制；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 L600-DP6高效液相色譜儀 （北京普析

通用儀器有限責(zé)任公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；梅特勒AB135-S電子分析天平（上海樹信儀器儀表有限公司）；SCQ-8201E超聲清洗儀（上海聲彥超聲波儀器設(shè)備有限公司）；水循環(huán)恒溫水浴箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；微型提取罐（上海雅程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；60-A多功能中藥切片機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 茯苓酸的含量測定 參考文獻(xiàn)[3]的方法。

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%甲酸水溶液（80∶20）為流動(dòng)相；檢測波長為242nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 取茯苓酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取茯苓粉末（過60目篩）約0.5g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇25mL，稱定，浸泡25min，超聲90min，放置，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，棄初濾液，準(zhǔn)確量取續(xù)濾液5mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘留物用甲醇定容至2mL容量瓶中，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 茯苓多糖的含量測定 參考文獻(xiàn)[4]的方法。

2.2.1 粗多糖的提取與精制 稱取茯苓藥材20g，加水煎煮提取2次，合并提取液，提取液以紗布濾過，放冷，離心 5min（2000r/min），分取上清液，濾液加乙醇使含醇量達(dá)80%，靜置過夜。過濾，殘?jiān)群笥脽o水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，于60℃減壓干燥，即得。

2.2.2 多糖的含量測定

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖103mg，置100mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，即得。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL， 分別置 25mL 刻度試管中，加入5%苯酚溶液1.00mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.00mL，加水至總體積10mL，搖勻，靜置 5min，置沸水浴中加熱15min，再置冷水浴中10min，補(bǔ)充失去的水分至刻度。以2mL蒸餾水同法操作作為空白對照，在490nm處，測吸光度，以葡萄糖濃度對吸收度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.0693C+0.0009（r=0.9992）。 試驗(yàn)結(jié)果表明，多糖含量以葡萄糖計(jì)在20.6～61.8μg/mL與吸收度線性關(guān)系良好。

2.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取多糖10.0mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作貯備液。

2.2.2.4 含量測定 精密吸取貯備液2mL，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法測定吸收度，從回歸方程中求出供試液中葡萄糖的濃度，再根據(jù)粗多糖的提取、精制和供試品溶液的制備方法，計(jì)算樣品中茯苓多糖以葡萄糖計(jì)的含量。

2.3 炮制工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 因素-水平表 根據(jù)簡化的炮制方法，以茯苓酸、茯苓多糖含量為指標(biāo)，以L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)，對發(fā)汗次數(shù)、飲片規(guī)格和烘干溫度進(jìn)行考察。因素-水平見表1。

表1 因素-水平表

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 見表2。對正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，可知各因素影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)汗次數(shù)＞烘干溫度＞飲片規(guī)格。在考察范圍內(nèi)，炮制工藝的最佳條件可選擇為：A3B2C2。表3為方差分析結(jié)果，由F值可知發(fā)汗次數(shù)有極顯著性影響，烘干溫度有顯著性影響。結(jié)合實(shí)際，確定炮制方法為：趁鮮，去皮，切制成厚片或丁，70℃烘干。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.4 對照實(shí)驗(yàn) 按照《中國藥典》（2010年版一部）茯苓加工方法和本實(shí)驗(yàn)確定的加工方法對茯苓藥材進(jìn)行處理，并分別測定茯苓酸和茯苓多糖的含量（n=3），結(jié)果見表4。從表4可見，按實(shí)驗(yàn)方法中測得的茯苓酸、茯苓多糖分別是藥典方法的136.70%、146.92%。

表4 對照實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

3 討論

到目前為止，關(guān)于茯苓炮制工藝的研究并不多。許臘英等[5]曾以茯苓多糖為指標(biāo)對茯苓炮制工藝進(jìn)行研究。本研究首次以茯苓酸和茯苓多糖的綜合作用對加工方法進(jìn)行考察，填補(bǔ)這方面的空白。《中國藥典》[1]（2010年版一部）茯苓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下收載以稀乙醇為溶劑，測定茯苓醇溶性浸出物，考慮到臨床中藥茯苓入中成藥的應(yīng)用因素，是否應(yīng)增加醇溶性浸出物為指標(biāo)，有待進(jìn)一步考察。

“發(fā)汗”是中藥材傳統(tǒng)加工處理方法之一，是將藥材采收后堆置，使其中水分溢出的方法。發(fā)汗法操作耗時(shí)長，無量化指標(biāo)，多憑經(jīng)驗(yàn)判斷?，F(xiàn)今社會(huì)對中藥飲片炮制品的生產(chǎn)要求規(guī)模化、自動(dòng)化，對生產(chǎn)的各過程均要嚴(yán)格控制。發(fā)汗法能否有合適的現(xiàn)代干燥方法替代，有待進(jìn)一步研究。

在多指標(biāo)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，綜合指標(biāo)的計(jì)算需對各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮和權(quán)衡，因茯苓酸和茯苓多糖的重要性一樣，故在綜合評分法中各占50%。如果茯苓飲片的干燥溫度過高，不僅會(huì)影響飲片中茯苓酸和茯苓多糖含量，而且會(huì)使飲片顏色加深，影響外觀性狀。

本研究確定的茯苓加工方法，操作簡單，茯苓飲片質(zhì)量重現(xiàn)性好，可為國家有關(guān)部門制定茯苓飲片炮制品標(biāo)準(zhǔn)提供可靠依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：224

[2] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（上冊）.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：554

[3] 昝俊峰，徐斌，於小波，等.全國20個(gè)主要產(chǎn)地茯苓質(zhì)量分析比較研究.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（8）：34

[4] 李俊艷，魏學(xué)軍，石朝珊，等.茯苓皮與茯苓塊中多糖的含量測定.黔南民族醫(yī)專學(xué)報(bào)，2009，22（4）：243

[5] 許臘英，付文強(qiáng)，萬芳，等.茯苓炮制工藝的研究.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，9（1）：44