李燕舞，李耿，巫燕莉

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣州510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510405)

補(bǔ)中益氣丸對脾虛大鼠能量物質(zhì)及AMPK的影響?

李燕舞1，李耿2，巫燕莉1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣州510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510405)

目的:從ATP、AMP、AMPK的變化探討脾虛證與能量代謝的關(guān)系。方法:采用高效液相色譜法檢測大黃脾虛大鼠ATP、AMP的變化，熒光定量PCR方法檢測AMPK-α基因的表達(dá)。結(jié)果:脾虛模型血漿、肝組織AMP/ATP均增高;肌肉中AMPK-α基因表達(dá)顯著降低，肝組織中AMPK-α基因表達(dá)顯著升高;補(bǔ)中益氣丸對上述模型中異常的能量物質(zhì)有調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:脾虛靜息狀態(tài)下ATP、AMP及AMPK在不同組織中表達(dá)不同，肝組織能量需求大于肌肉組織，補(bǔ)中益氣丸可以調(diào)整脾虛狀態(tài)下紊亂的能量物質(zhì)。

脾虛證;AMPK;能量代謝;AMP/ATP;補(bǔ)中益氣丸

物質(zhì)代謝是生命的最基本特征，能量代謝是物質(zhì)代謝過程中所伴隨能量的釋放、轉(zhuǎn)移和利用，它與中醫(yī)“脾主運(yùn)化，脾為后天之本”、“脾主肌肉”等理論密切相關(guān)。脾主運(yùn)化的過程包含著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)論述的營養(yǎng)物質(zhì)吸收過程，是一個主動耗能、不斷消耗ATP的過程。脾虛證是中醫(yī)脾胃病常見的病證之一，若脾虛失運(yùn)則臟腑、肌肉無以充養(yǎng)，各器官的功能活動則會減退［1］?？梢姡⑻撟C的基本病理機(jī)制之一可能與機(jī)體臟腑、肌肉能量代謝障礙密切相關(guān)。

AMPK(磷酸腺苷活化蛋白激酶，AMP-activated protein kinase)在真核細(xì)胞生物中廣泛存在，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AMPK能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，并通過影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量的供求平衡。作為能量感受器，AMPK通過感知細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化來調(diào)控線粒體功能，從而維持能量穩(wěn)態(tài)［2］。本研究以脾虛大鼠模型為研究對象，從不同組織能量代謝物質(zhì)ATP、AMP及AMPK的變化探討脾虛證與能量代謝的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠36只，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號SCXK(粵)2008-0002)。飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心及廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房，實(shí)驗(yàn)室為國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研三級實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

RNAiso Plus(total RNA提取試劑)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqII均由TaKaRa公司提供; AMPK及GAPDH引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 儀器

高速低溫離心機(jī)(sigma)，梯度PCR儀(TaKaRa)，TP800熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo Scientific)，超凈工作臺(蘇凈安泰)。

1.4 方法

1.4.1 造模及給藥大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、脾虛模型組、補(bǔ)中益氣丸治療組各12只。脾虛模型采用100%大黃水煎液灌胃，灌胃體積1 ml/100 g，每日2次，連續(xù)10 d。造模結(jié)束后治療組給予補(bǔ)中益氣丸(3 g/kg)，正常對照及模型組均給予等體積蒸餾水，連續(xù)7 d。

1.4.2 樣品處理腹主動脈采血(抗凝)1 ml，加入等體積7%高氯酸充分混合，4000 r/min離心10 min收集上清;用10%KOH中和至PH為7.0，10000 r/min離心10 min取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。取肝組織、肌肉組織各約1 g，分別放入含有1.5 ml 7%高氯酸的預(yù)冷試管中，依次加入0.5 ml KOH(1 mol/L)，研磨組織，離心3000 r/min×10 min取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾器過濾后-80℃保存?zhèn)溆?。另取肝臟及肌肉組織各1份，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 高效液相色譜法(HPLC)檢測色譜條件:色譜柱:Phenomenex-ODS(250 mm×4.0 mm，5 μm);流動相:甲醇∶磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)(2∶98)，柱溫30℃;檢測波長:254 nm，流速0.6 ml· min-1，進(jìn)樣量10 μL。線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)及樣品測定:用純凈水分別配制梯度ATP、AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取10 μL注入液相色譜儀，按照色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積(mA μ×min)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(ug/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程及線性系數(shù)。

1.4.4RT-PCR檢測肌肉及肝組織樣品中AMPK-α mRNA含量取0.1 g肌肉或肝臟組織提取總RNA。在超微量核酸蛋白檢測儀檢測計(jì)算樣品RNA含量并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。AMPK-α引物:5’-TGAGCTTACAGCTTTACCTGGTTGA-3’，5’-CACTT GACCGAGGTCTGTGGA-3’。PCR反應(yīng)條件:95℃5 s，60℃30 s，72℃45 s，40個循環(huán)，分析熒光信號并采用相對定量法中2-△△Ct法計(jì)算靶基因表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0，軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用大黃型脾虛造模法，該模型在脾虛證的復(fù)制應(yīng)用中已得到較多認(rèn)可。大黃性苦寒，歸脾、胃、腸三經(jīng)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為過量和長時間服用苦寒藥可導(dǎo)致?lián)p傷脾胃。我實(shí)驗(yàn)室長期從事脾虛證的相關(guān)研究，大黃脾虛模型應(yīng)用較多，模型動物可見體質(zhì)量輕微降低、稀便、納呆、少動扎堆、毛發(fā)苦澀等類似臨床“脾虛”癥狀，胃、腸道病理檢測未見明顯異常。既往研究表明，該模型大鼠胃泌素受體表達(dá)顯著降低。該模型負(fù)荷應(yīng)激因素可導(dǎo)致動物胃黏膜損傷明顯加重，而益氣健脾中藥對上述癥狀均有改善作用［3-4］。

2.2HPLC線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1顯示，ATP在0.75～75 ug/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r為0.9991，回歸方程為y=0.2864xΣ 0.54。AMP在0.75～39 ug/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r為0.9994，回歸方程為y=0.4636x+0.0112。

圖1 ATP、AMP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 各樣本AMP、ATP含量檢測結(jié)果

表1顯示，AMP在肝組織中含量最高，其次是肌肉，再次是血漿。與正常組大鼠比較，脾虛模型大鼠肌肉AMP含量明顯降低(P＜0.01)，而血漿、肝組織AMP含量明顯增高(P＜0.01);經(jīng)補(bǔ)中益氣丸治療后，模型組血漿AMP含量明顯降低(P＜0.01)，而肌肉組織AMP含量有顯著提高(P＜0.05)。

表1顯示，ATP在肌肉中含量最高，其次是肝組織，再次是血漿。與正常組大鼠比較，模型大鼠肌肉、肝組織ATP含量明顯降低。經(jīng)補(bǔ)中益氣丸干預(yù)后，模型大鼠肌肉及肝組織ATP含量均顯著增高，提示補(bǔ)中益氣丸干預(yù)對大黃脾虛模型肌肉、肝組織能量物質(zhì)的降低有顯著逆轉(zhuǎn)作用。

2.4AMP/ATP結(jié)果

表2顯示，與正常對照組比較，模型組血漿、肝組織AMP/ATP均增高(P＜0.01);經(jīng)補(bǔ)中益氣丸干預(yù)后，血漿、肌肉、肝組織AMP/ATP均有下調(diào)(P＜0.01)。

2.5AMPK-α基因表達(dá)結(jié)果

表3顯示，與正常對照組比較，脾虛模型肌肉中AMPK-α基因表達(dá)顯著降低(P＜0.01);而脾虛模型肝組織中AMPK-α基因表達(dá)顯著升高(P＜0.01);補(bǔ)中益氣丸干預(yù)后，上述指標(biāo)均有逆轉(zhuǎn)(P＜0.01)。

表1 脾虛大鼠血漿、肌肉、肝組織AMP、ATP含量變化(μg/ml，±s)

表1 脾虛大鼠血漿、肌肉、肝組織AMP、ATP含量變化(μg/ml，±s)

注:與正常對照比較:##P＜0.01;與脾虛模型比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別鼠數(shù)血漿肌肉肝組織正常對照組12AMP12.44±7.21276.97±86.23333.08±170.23?ATP62.81±20.211143.67±270.43572.66±111.82脾虛模型組10AMP20.72±5.11##97.47±43.13##687.36±292.38##ATP64.25±18.63487.44±181.09##317.03±49.96##補(bǔ)中治療組10AMP8.79±3.28＊＊131.86±81.40*666.06±149.09 ATP73.63±25.95789.61±176.60＊＊722.85±139.01＊＊

表2 脾虛大鼠血漿、肌肉、肝組織AMP/ATP的變化(±s)

表2 脾虛大鼠血漿、肌肉、肝組織AMP/ATP的變化(±s)

注:與正常對照比較:##P＜0.01;與脾虛模型比較:＊＊P＜0.01

組別鼠數(shù)AMP/ATP血漿肌肉肝組織正常對照組120.198±0.0970.253±0.0980.565±0.222脾虛模型組100.340±0.104##0.315±0.0952.144±0.811##補(bǔ)中治療組100.128±0.059＊＊0.163±0.075＊＊0.928±0.172＊＊

表3 脾虛大鼠肌肉、肝組織AMPK-α基因表達(dá)變化(±s)

表3 脾虛大鼠肌肉、肝組織AMPK-α基因表達(dá)變化(±s)

注:與正常對照比較:##P＜0.01;與脾虛模型比較:＊＊P＜0.01

組別鼠數(shù)AMPK-α基因表達(dá)肌肉肝組織正常對照組100.942±0.5151.186±0.368脾虛模型組100.303±0.176##2.767±1.444##補(bǔ)中治療組100.937±0.236＊＊0.832±0.434＊＊

3 討論

脾的運(yùn)化功能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)化與代謝過程十分相似，包括葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等分解代謝及能量轉(zhuǎn)化，因此中醫(yī)“脾”的功能與能量代謝密切相關(guān)。AMP、ATP是能量生成和利用系統(tǒng)的橋梁，每種營養(yǎng)物質(zhì)作為能量來源，被利用的比例取決于機(jī)體的組織、飲食和激素狀態(tài)。有研究表明，脾虛狀態(tài)下Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性均有所降低，能量產(chǎn)生不足，能源物質(zhì)匱乏，故臨床病人和脾虛證動物出現(xiàn)神疲乏力、肌肉消瘦等癥狀［5-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃脾虛大鼠模型肌肉、肝組織中ATP含量明顯降低，與文獻(xiàn)報道大黃脾虛模型大鼠小腸組織ATP含量降低一致［8］，提示脾虛狀態(tài)下機(jī)體能量物質(zhì)低下，而益氣健脾經(jīng)典方補(bǔ)中益氣丸對此有明顯的復(fù)建作用。

AMPK作為細(xì)胞能量感受器，通過感知細(xì)胞內(nèi)AMP與ATP比值的變化來調(diào)控線粒體的功能，從而維持能量穩(wěn)態(tài)。AMP/ATP比值升高會激活A(yù)MPK，從而啟動分解代謝的信號通路，同時抑制合成代謝的信號通路，提高細(xì)胞ATP水平。AMPK由α、β、γ 3個亞單位組成，α亞單位172位蘇氨酸(Thr172)的磷酸化是AMPK激活的主要機(jī)制［9-10］。有不少研究對“脾”與線粒體、能量代謝的關(guān)系進(jìn)行了探討，主要集中在對脾虛證線粒體形態(tài)改變以及能量代謝相關(guān)酶活性的研究［11-12］，尚未見到從AMPK角度分析脾虛證與能量代謝的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛狀態(tài)下，機(jī)體肝及肌肉組織能量物質(zhì)ATP含量均明顯降低，AMP/ATP比值有所增高，而AMPK-α基因表達(dá)卻不同。脾虛模型肌肉中AMPK-α基因表達(dá)顯著降低，提示AMPK活性有可能下調(diào)，能量代謝物質(zhì)生成減少;而脾虛模型肝組織中AMPK-α基因表達(dá)顯著升高，AMP/ATP也明顯增高，提示AMPK基因及活性增高，能量物質(zhì)生成增加?？梢姡⑻撃Ｐ筒煌M織中AMPK表達(dá)有所區(qū)別，內(nèi)臟中能量物質(zhì)的提供優(yōu)于四肢，符合機(jī)體安靜狀態(tài)下的供能需求。補(bǔ)中益氣丸作為益氣健脾的經(jīng)典方劑，對脾虛狀態(tài)下異常的能量代謝物質(zhì)均有顯著調(diào)節(jié)作用。關(guān)于脾虛證與機(jī)體能量代謝特別是與AMPK的關(guān)系，有待于通過負(fù)荷試驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。

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Influences of Buzhong Yiqi Pill on Energy Substance and AMPK of Spleen Deficiency Syndrome Rat

LI Yan-wu1，LI Geng2，WU Yan-li1

(1．Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2．School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

Objective:To discuss the relationship of spleen deficiency syndrome and energy metabolism based on the changes of ATP，AMP and AMPK.Methods:Spleen deficiency syndrome rat model was made by intragastric administration of Rheum.ATP and AMP in plasma，muscle and liver were detected by HPLC.AMPK-α expression in muscle and liver were detected by RT-PCR.Results:Compared with normal group，AMP/ATP ratio were increased obviously in the plasma and liver of model group.AMPK-α gene expression in muscle of model decreased obviously but increased in liver.Buzhong Yiqi pill could regulate the abnormal energy substance above in the model group.Conclusions:There are some differences of ATP，AMP and AMPK in different tissues，and energy supply in liver could be more than in muscle in the spleen deficiency syndrome.Buzhong Yiqi pill could regulate the disordered energy substances in the spleen deficiency syndrome.

spleen deficiency syndrome;AMP-activated protein kinase;energy metabolism;AMP/ATP;Buzhong YiqiPill

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0592-03

2015-02-15

廣州中醫(yī)藥大學(xué)特色重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(財教［2013］339號)

李燕舞(1976-)，女，陜西西安人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事調(diào)理脾胃中藥的藥理研究。