邵毅，余瑤，裴重剛，胡佩宏，楊璐，黃歆，涂萍

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌330006；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南昌第三醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江西 南昌330009）

術(shù)后結(jié)膜傷口愈合不良是青光眼濾過術(shù)晚期失敗的主要原因[1]。有些疤痕體質(zhì)的患者，盡管使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）或絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）仍可能導(dǎo)致晚期濾過泡形成失敗[2]。青光眼濾過術(shù)后的傷口瘢痕問題，已成為眼科的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因此，尋找安全、有效、副作用小的抗瘢痕藥物極為關(guān)鍵[3]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種新型抗纖維化藥物，動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)已證明其具有抗纖維化的潛力[4]。PFD能下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）[5]，也可以清除活性氧，從而抑制組織修復(fù)[6]。在人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞，PFD可以阻止TGF-β1誘導(dǎo)的纖連蛋白合成[7]。此外，PFD能抑制白介素-1誘導(dǎo)的金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metallopro teinases 1，TIMP1），增加甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶成纖維細(xì)胞的抗纖維化作用[8]。而本研究旨在探討PFD在兔小梁切除術(shù)后抑制結(jié)膜濾過泡瘢痕化的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 PFD滴眼液的制備

將PFD粉末（P2116，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于無(wú)菌水中，配成濃度約5mg/ml（0.5%）的溶液，保存于4℃冰箱內(nèi)，有效時(shí)間為24 h。

1.2 手術(shù)方法和分組

26只新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，檢查無(wú)眼部疾患及全身器質(zhì)性疾病。2只作為陰性對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)操作過程和方法均遵循ARVO委員會(huì)規(guī)定的眼科和視覺科學(xué)相關(guān)的動(dòng)物使用原則，符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。兔子飼養(yǎng)在18～25℃標(biāo)準(zhǔn)的恒溫動(dòng)物箱內(nèi)，12 h光照/黑暗周期，同時(shí)給予標(biāo)準(zhǔn)的食物和水進(jìn)行喂養(yǎng)。24只兔子（24只眼，均為右眼）隨機(jī)分為兩組：所有兔經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）和局部用0.5%的鹽酸丙美卡因表面麻醉，0.5%碘伏消毒。鋪巾開瞼，剪去第3眼瞼，置上、下、內(nèi)、外直肌牽引線，固定眼球，在顯微鏡手術(shù)條件下，于右眼上象限鞏膜區(qū)進(jìn)行常規(guī)小梁切除術(shù)。約1/2厚的梯形鞏膜瓣，大小約4mm×3mm×3mm，切除約1.5mm×3.0mm的小梁組織和部分虹膜組織，用10-0尼龍線縫合鞏膜瓣和結(jié)膜瓣，手術(shù)結(jié)束時(shí)結(jié)膜下注射地塞米松1ml。A組給予0.5%（5mg/ml）PFD滴眼液滴眼，B組給予磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）滴眼，連續(xù)使用28 d。所有手術(shù)均在手術(shù)顯微鏡（VISU150，卡爾蔡司，德國(guó)）下進(jìn)行，并由同一熟練操作者完成，術(shù)后涂紅霉素眼藥膏。此外，術(shù)后1周用諾氟沙星滴眼液點(diǎn)手術(shù)眼，3次/d。隨訪至術(shù)后28 d。用0.5%鹽酸丙美卡因麻醉后，用Tonocon眼壓計(jì)記錄兔雙眼眼壓。手術(shù)后1、7、14、21和28 d分別觀察兔眼濾過泡及并發(fā)癥，共聚焦顯微鏡檢查兔眼濾過泡情況，同時(shí)使用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)比觀察手術(shù)區(qū)的組織變化。

1.3 共聚焦顯微鏡檢查

采用Confoscan 4裂隙掃描共聚焦顯微鏡（Nidek Co.LTD，日本）檢查。操作步驟[9]：待檢兔眼表面麻醉后，將兔頭部固定顯微鏡前，雙眼固視正前方，檢查者移動(dòng)鏡頭使共焦顯微鏡與結(jié)膜上皮細(xì)胞接觸時(shí)，將鏡頭緩慢向前推進(jìn)，于結(jié)膜濾過泡區(qū)進(jìn)行全層掃描，結(jié)束后選擇有價(jià)值的圖像和錄像存盤，并計(jì)算平均微囊密度及平均微囊面積[10]。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

手術(shù)后7、14、21、28和56 d，取濾過泡區(qū)的組織（包括結(jié)膜、筋膜和鞏膜）進(jìn)行CTGF的RT-PCR[3]。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)得到的組織在1m l提取試劑（Trizol試劑，武漢生命技術(shù)有限公司，中國(guó)）中勻漿，用cDNA合成試劑盒（Toyobo，日本）合成cDNA。在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（SLAN紅石醫(yī)藥科技有限公司，中國(guó)），使用SYBR預(yù)混的Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。通過比較閾值循環(huán)方法進(jìn)行結(jié)果分析，并通過管家基因β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 4.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較兩組眼壓差異、結(jié)膜囊泡密度和面積等用單因素方差分析Studentt檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濾過泡情況

A組術(shù)后第7天可見有輕微的結(jié)膜充血和良好的濾過泡存在，術(shù)后14 d，結(jié)膜稍充血，濾過泡形成良好，觀察28 d后沒有明顯的炎癥反應(yīng)，濾過泡仍隆起、彌散；B組術(shù)后第7天可見結(jié)膜充血和良好的濾過泡，術(shù)后14 d，結(jié)膜充血減輕，濾過泡平坦，瘢痕形成，觀察28 d后大部分濾過泡瘢痕化。術(shù)后1、7和14 d兩組的濾過泡評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1d=0.326，t7d=0.652，t14d=0.959，均P>0.05）；術(shù)后21和28 d兩組的濾過泡評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t21d=9.142，t28d=15.741，均P<0.05）（見表1）。觀察兩組無(wú)一例眼內(nèi)炎、前房出血和白內(nèi)障發(fā)生，少數(shù)出現(xiàn)傷口一過性的周圍角膜水腫。

2.2眼壓

手術(shù)前和手術(shù)后1、7、14、21和28 d的早上8～9點(diǎn)測(cè)定眼壓。在術(shù)前每組眼壓與正常對(duì)照組比較，均有明顯降低（tA=6.732，tB=6.837，均P<0.05）。術(shù)后早期眼壓明顯降低，但隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。術(shù)前及術(shù)后1和7 d，兩組眼壓比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t術(shù)前=0.352，t1d=0.647，t7d=0.753，均P>0.05）；術(shù)后14、21和28 d，兩組眼壓比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t14d=3.463，t21d=4.056，t28d=5.194，均P<0.05）。見表2。

2.3 共聚焦顯微鏡結(jié)果

正常結(jié)膜上皮基底細(xì)胞顯示為光暗的細(xì)胞體，細(xì)胞邊界窄（見圖1A）。經(jīng)過0.5%PFD滴眼液處理28 d的A組在結(jié)膜濾過泡區(qū)上皮及基質(zhì)層出現(xiàn)了許多大小不一的微囊泡，周邊可見部分呈亮光樣炎癥細(xì)胞包繞（見圖1B）；而經(jīng)過PBS處理的B組在結(jié)膜濾過泡區(qū)上皮及基質(zhì)層可見少許的小微囊泡及少量的亮光樣炎癥細(xì)胞（見圖1C）。通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療28 d后，A組結(jié)膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（112±22）個(gè)/mm2和（28 589±14 268）μm2，而B組結(jié)膜上皮下平均微囊密度和平均微囊面積分別為（26±19）個(gè)/mm2和（4 989±2 329）μm2，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tmd=16.842，tma=14.894，均P<0.05，見圖1D，1E）。

2.4 mRNA檢測(cè)

A組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)在濾過泡區(qū)CTGFmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而B組CTGF在濾過泡區(qū)CTGF mRNA未見明顯改變，兩組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t7d=2.476，t14d=4.892，t21d=7.638，t28d=9.452，均P<0.05），見圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段兔結(jié)膜濾過泡評(píng)分比較 （n=12，±s）

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段兔結(jié)膜濾過泡評(píng)分比較 （n=12，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后21 d 術(shù)后28 d A-3.26±0.14 3.72±0.46 3.66±0.65 4.32±0.64 4.17±0.73 3.36±0.25 3.66±0.38 3.23±0.29 3.18±0.43 2.51±0.37 t值 - 0.326 0.652 0.959 9.142 15.741 P值 - 0.973 0.652 0.326 0.048 0.025 B -

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前和術(shù)后各時(shí)段眼壓比較 （n=12，mmHg，±s）

組別 術(shù)前 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后21 d 術(shù)后28 d A 16.24±0.26 12.81±0.38 13.26±0.41 13.45±0.36 13.84±0.43 14.15±0.51 17.46±0.22 12.52±0.42 13.52±0.47 14.57±0.52 16.22±0.58 17.28±0.62 t值 0.352 0.647 0.753 3.463 4.056 5.194 P值 0.982 0.864 0.745 0.044 0.028 0.016 B

圖1 兩組術(shù)后28 d兔結(jié)膜濾過泡的共焦顯微鏡圖像

圖2 兩組兔結(jié)膜手術(shù)區(qū)CTGF mRNA表達(dá)

3 討論

青光眼是導(dǎo)致不可逆性盲的主要原因，是僅次于白內(nèi)障導(dǎo)致失明的第2大常見原因，發(fā)病率約為0.21%～1.64%[11]。目前，濾過性手術(shù)仍是青光眼的主要治療手段，但鞏膜表層、Tenon囊和球結(jié)膜之間成纖維細(xì)胞增生、膠原合成增加等，使濾過道瘢痕化而影響其濾過功能[12]，導(dǎo)致手術(shù)失敗。為了抑制瘢痕形成，防止濾過道瘢痕化，目前術(shù)中常用的抗代謝藥物如5-FU和MMC均可以防止術(shù)后瘢痕形成，但常常會(huì)導(dǎo)致結(jié)膜泡漏、低眼壓、鞏膜溶解、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥[13]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)類固醇可以減少濾過道纖維細(xì)胞增生。尹寶存[14]采用濾過性手術(shù)聯(lián)合局部點(diǎn)用皮質(zhì)類固醇藥物治療急性閉角型青光眼急性發(fā)作及慢性閉角型青光眼，有效地解決了術(shù)后炎癥和傷口愈合過程中纖維組織增生、濾過道瘢痕化的難題。但其在低濃度時(shí)不僅不能抑制成纖維細(xì)胞增殖，反而能起到促進(jìn)作用，局部低濃度滴藥造成濾過道的纖維化，而結(jié)膜下注射易形成無(wú)功能濾過泡，且長(zhǎng)期應(yīng)用并發(fā)癥多。

術(shù)后濾過道瘢痕化是青光眼濾過手術(shù)后期失敗的主要原因，是眼壓長(zhǎng)期有效控制和視神經(jīng)損害保護(hù)的一個(gè)重大障礙。近年來(lái)，抗濾過道瘢痕化藥物作用被越來(lái)越多的人肯定，手術(shù)聯(lián)合各類抗瘢痕藥物的優(yōu)勢(shì)也逐漸凸顯，在拓寬了手術(shù)適應(yīng)范圍的同時(shí)，也保證了手術(shù)的成功率，增加了青光眼患者復(fù)明的希望。PFD在體外的很多細(xì)胞（例如肝星狀細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、子宮肌層細(xì)胞及肌瘤細(xì)胞）和許多器官（例如腎、肺和肝臟）有抗炎和抗纖維化的作用。目前，PFD在若干臨床試驗(yàn)中得到了應(yīng)用，包括肥厚性心肌病、肺纖維化、神經(jīng)纖維瘤、子宮平滑肌瘤、特發(fā)性硬皮病、硬化性腹膜炎和輻射誘發(fā)的纖維化等。雖然PFD在眼部的抗纖維化機(jī)制仍不清楚，但有研究表明，PFD能下調(diào)人眼球筋膜成纖維細(xì)胞TGF-β1的mRNA的表達(dá)，對(duì)其增殖、遷移及其在體外的膠原收縮具有明顯的抑制作用。前期已經(jīng)研究了青光眼與全身疾病如阿爾默海茨病[15]、帕金森病[16]等的關(guān)系，以及一部分抗瘢痕的物質(zhì)如紅花保存羊膜[3]、晶狀體前囊膜等[17]在青光眼的應(yīng)用，目前的初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFD能調(diào)節(jié)青光眼小梁切除手術(shù)區(qū)的鞏膜瓣和結(jié)膜組織CTGF mRNA的表達(dá)，且濾過泡形成良好，有明顯的抗瘢痕作用。

總之，本文通過實(shí)驗(yàn)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)PFD滴眼液在兔小梁切除術(shù)后能減少術(shù)后結(jié)膜鞏膜間的瘢痕愈合。其原因可能是青光眼小梁切除術(shù)后濾過泡容易粘連而產(chǎn)生瘢痕化，而PFD滴眼液能有效抗瘢痕，保持濾過道通暢，所以濾過泡存活得更為持久。隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織工程學(xué)的建立及學(xué)科間的交叉發(fā)展，闡明青光眼濾過道愈合的過程，進(jìn)一步研究現(xiàn)有抗纖維化藥物抗瘢痕化的作用機(jī)制，尋找療效好、毒副作用小、來(lái)源豐富的成分，仍是青光眼術(shù)后抗瘢痕化的研究方向。目前，大多數(shù)研究還處于體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚有待于進(jìn)一步明確PFD對(duì)青光眼濾過道瘢痕化作用的相關(guān)機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)通道，這將為臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的研究奠定可靠的基礎(chǔ)。

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