史小玲，李燕，王曉燕，唐利，陳楓，鐘森，陳莊

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實驗中心，四川 瀘州646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075）

基因疫苗又稱DNA疫苗，是近年來研究的一種新型疫苗，成分清楚，制備簡單，可產(chǎn)生強烈而持久的細胞和體液免疫應(yīng)答，而成為免疫調(diào)節(jié)劑的較好選擇，在疫苗研究中倍受關(guān)注[1]。目前，已有4種DNA疫苗產(chǎn)品經(jīng)許可用于畜禽疾病治療，并且DNA疫苗正以更加優(yōu)化的結(jié)構(gòu)、更好的設(shè)計應(yīng)用于人類疾病治療的臨床研究[2]。在之前的實驗中，筆者將結(jié)核桿菌HSP70基因與人CD80基因拼接，并以pcDNA3.1（+）為載體構(gòu)建嵌合DNA真核表達質(zhì)粒[3]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該嵌合DNA質(zhì)粒，對結(jié)核桿菌有很強的抑制作用，并能使IFN-γ 明顯增高[4]。在哮喘小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)它能有效減輕炎癥細胞浸潤，且小鼠肺泡洗脫液中IFN-γ 明顯升高[5]。由于pcDNA3.1（+）含有氨卞霉素抗性篩選基因，不能用于人體實驗。因此，本實驗選用美國食品和藥品管理委員會（FDA）推薦唯一可用于人體實驗的質(zhì)粒pVAX1作為載體重新構(gòu)建，并觀察其在體內(nèi)外的表達和免疫反應(yīng)，以期為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pcDNA3.1-Hsp70/CD80真核表達質(zhì)粒為本實驗室前期構(gòu)建保存，質(zhì)粒pVAX1、感受態(tài)細胞E.coli DH5α 購于Invitrogen公司，人胚腎細胞293T細胞購于中國科學(xué)院細胞庫，SPF級雌性健康BALB/c小鼠20只購自第三軍醫(yī)大學(xué)[合格證號SCXK（渝）2007-0003]，限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ、T4連接酶購自New England Biolabs，DNA膠回收試劑盒購自大連寶生物公司，Endofree Plasmid Giga Kit購自Qiagen公司，Lipofectamine LTX and Plus Reagen購于Invitrogen公司，鼠抗結(jié)核桿菌Hsp70單克隆抗體購自Lifespan Biosciences公司，鼠抗人CD80單克隆抗體購自Abcam公司，Western blot試劑購自上海碧云天生物公司，總RNA提取試劑盒（離心柱型）購自北京天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購自大連寶生物公司；Sso FastEva Green Supermix購自Bio-Rad公司，BIO-ROD核酸蛋白成像儀，iCycler iQ Real-time PCR擴增儀。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hs p70/C D80 的構(gòu)建與鑒定 HindⅢ和XbaⅠ酶切既往構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA 3.1-Hsp70/CD80和載體PVAX1，將目的基因Hsp70/CD80定向連接入已酶切pVAX1中，構(gòu)建質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80，酶切鑒定后由上海生工生物工程有限公司進行測序。將pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α。用QIAGEN公司去內(nèi)毒素級質(zhì)粒大量提取試劑盒，按說明書提取純化的質(zhì)粒DNA。

1.2.2 pVAX1-Hs p70/C D80 體外瞬時表達 收集對數(shù)生長期的293T細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，使細胞匯合度達到50%～80%時，按Lipofectamine LTX and Plus Reagen轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收獲細胞，加入裂解液釋放蛋白質(zhì)，離心取上清，與5×上樣緩沖液混勻并煮沸使蛋白質(zhì)變性。SDS-page電泳，轉(zhuǎn)膜。分別加入Hsp70、CD80一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑置于核酸蛋白成像儀成像。

1.2.3 pVAX1-Hs p70/C D80 體外穩(wěn)定表達 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，按1×104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，并進行有限稀釋。培養(yǎng)24 h后加入1 000mg G418篩選。篩選10～14 d后，有大量細胞死亡，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，以500mg G418維持，擴增培養(yǎng)。獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系命名為293T-HSP70/CD80。Western blot檢測Hsp70、CD80蛋白表達。方法同上。

1.2.4 動物實驗 近交系BALB/c小鼠20只，飼養(yǎng)于獨立通風(fēng)換氣籠具（individually ventilated cages，IVC）中。動物按注射時間分為7 d組、15 d組、30 d組、180 d組，共5組（每組3只）。7 d組、15 d組、30 d組和180 d組小鼠股四頭肌分別注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒和7.5 g/L布比卡因混懸液（4∶1）125μl，含質(zhì)粒100μg，注射125μl生理鹽水代替。對照組小鼠分別于注射后7、15、30和180 d處死，并取眼球血以及肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織冷凍儲存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 R T-PCR 檢測Hs p70 和C D80 在小鼠體內(nèi)的表達 從肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織中提取RNA，按總RNA提取試劑盒說明書進行操作。按TaKaRa RNA PCRKit說明書制備cDNA模板，并進行PCR反應(yīng)。引物序列：HSP70上游引物CGTCGTCTCGGTTCTGGAAGGTG，下游引物CATTG AAGTAGGCGGGCGTCGTG；CD80上游引物ACACG GAGGCAGGGAACATCACC，下游引物TGGGCGCAG AGCCAGGATCACA。PCR結(jié)果行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 Real-time PCR 檢測小鼠脾臟組織中IFN-γ 和IL-4 表達 從脾臟中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。進行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列：IFN-γ 上游引物：AACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG，下游引物：GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG；IL-4上游引物：TTTTGAACGAGGTCACAGGAGAGG，下游引物：CCTTGGAAGCCCTACAGACGAG；β-actin上游引物：AGGGTGTGATGGTGGGAAT，下游引物：CTCGGTGAGCAGCACAGG。反應(yīng)完成后用Bio-Rad iQ5軟件進行分析，按照Pfaffl法計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80構(gòu)建與鑒定

經(jīng)內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切前后的瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果符合預(yù)期，表明其建立成功。見圖1。送上海生工生物工程有限公司測序后證實該質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Western blot檢測pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染

293T細胞的蛋白質(zhì)真核瞬時表達和穩(wěn)定表達結(jié)果見圖2，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293T細胞均有33和72 kD左右的蛋白表達；轉(zhuǎn)染前293T細胞無表達。

2.3 pVAX1-Hsp70/CD80 mRNA體內(nèi)表達分布

RT-PCR檢測接種7和15 d肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織均有Hsp70和CD80表達。接種30 d肌肉、肺和肝有Hsp70表達，未見CD80表達。180 d均未檢測出Hsp70/CD80表達，見圖3。

2.4 Real time PCR檢測IFN-γ 和IL-4基因表達

結(jié)果顯示，注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒7和15 d后IFN-γ 有高水平表達，且高于對照組（P<0.05）。注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒180 d后IFNγ 基因表達降低，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖1 重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80雙酶切電泳圖

圖2 pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染293T細胞瞬時表達和穩(wěn)定表達

圖3 Hsp70和CD80在各組織中的表達

圖4 注射pVAX1-Hsp70/CD80質(zhì)粒后7、15、30和180 d IFN-γ 和IL-4基因表達量

3 討論

分枝桿菌熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）包含多個T細胞和B細胞表位，可激活效應(yīng)細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具有免疫優(yōu)勢抗原的特點。還具有結(jié)合和呈遞抗原肽的作用，能夠干擾多種細胞內(nèi)炎癥信號通路，從而抑制炎癥反應(yīng)[6]，調(diào)節(jié)機體的免疫平衡[7]。CD80（B7-1）表達于活化的B、T淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及外周血單核細胞，具有免疫活化功能，是重要的共刺激分子之一。CD80與其共刺激配體CD28和/或CTLA-4是活化T淋巴細胞時的刺激因子，在體液免疫和細胞免疫中發(fā)揮重要的全面活化作用[8]。有研究表明[9]，CD80與其配體CTLA-4結(jié)合會對致敏過程中變應(yīng)原特異性調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生抑制作用。本實驗中，將拼接的結(jié)核桿菌HSP70和人CD80編碼基因定向連接于pVAX1中，經(jīng)酶切和測序鑒定構(gòu)建質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80成功。應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pVAX1-Hsp70/CD80轉(zhuǎn)染入293T細胞，經(jīng)G418篩選后，獲得陽性克隆，通過Western blot鑒定，證實Hsp70和CD80在該細胞水平均有表達。

與傳統(tǒng)疫苗比較，DNA疫苗具有多方面的優(yōu)點[10]。但是DNA疫苗的安全性和有效性是在進入臨床治療前必須首先滿足的要求。目前，研究大多數(shù)偏重于功能性DNA疫苗的構(gòu)建，而較少考慮到其安全性的問題。本文在上述體外實驗基礎(chǔ)上，檢測pVAX1-Hsp70/CD80接種小鼠后Hsp70和CD80在各組織的表達及小鼠的免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示接種后7和15 d組肌肉、淋巴結(jié)、骨髓、脾、肝、肺、腎、胸腺組織均有Hsp70和CD80表達，且脾臟IFN-γ 基因有較高水平表達。說明該質(zhì)粒能廣泛表達Hsp70和CD80，并能誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生較高表達，對機體免疫反應(yīng)有明顯的調(diào)節(jié)作用。目前，涉及質(zhì)粒DNA廣泛生物分布的機制尚不清楚。據(jù)推測，可能是由于載體質(zhì)粒的運輸或轉(zhuǎn)染細胞的運輸作用[11]。然而，質(zhì)粒DNA在體內(nèi)廣泛分布不能只限于一個特定的機制或細胞類型。裸DNA免疫機體后，它可以通過不同的細胞，如細胞CD11b+（2），CD11c（23，24），CD11c和CD19（3）到達遠處的臟器[12]。同時，也不能排除質(zhì)粒DNA通過血液或淋巴系統(tǒng)運輸。然而，接種30 d在肌肉、肺和肝有Hsp70表達，未見CD80表達，且脾臟IFN-γ 基因表達明顯降低。180 d后未檢測出表達，IFN-γ 基因表達幾乎降低到對照組水平。說明其表達雖然廣泛但有一定時間性，不會長期無限制表達而打亂機體自身免疫平衡，這為疫苗在后續(xù)實驗研究中奠定了理論基礎(chǔ)，也為該疫苗在臨床應(yīng)用提供了可能。

[1]WEISS R,HAMMERL P,HARTL A,et al.Design of protective and therapeutic DNA vaccines for the treatment of allergic dis eases[J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4(5):585-597.

[2]KUTZLER MA,WEINER DB.DNA vaccines: ready for prime time[J].Nat Rev Genet,2008,9(10):776-788.

[3]李暉,史小玲,鐘森.HSP70/CD80嵌合DNA真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(4):244-245.

[4]史小玲,李暉,鐘森,等.HSP70/CD80嵌合DNA疫苗對結(jié)核桿菌的治療作用[J].中華傳染病雜志,2004,22(1):30-33.

[5]成爭艷,史小玲,李燕,等.HSP70/CD80嵌合DNA疫苗對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2009,29(11):981-986.

[6]BORGES TJ,WIETEN L,VAN HERWIJNEN MJ,et al.The anti-inflammatory mechanisms of Hsp70[J].Front Immunol,2012,3:95.

[7]TSAN MF,GAO B.Heat shock proteins and immune system[J].Leukoc Biol,2009,85(6):905-910.

[8]GARRIDO C,BRUNET M,DIDELOT C.Heat shock proteins 27 and 70: anti-apoptotic proteins with tumorigenic properties[J].Cell Cycle,2006,5(22):2592-2601.

[9]LOMBARDI V,SINGH AK,AKBARI O.The role of co stimulatory molecules in allergic disease and asthma[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,151(3):179-189.

[10]CHUA KY,KUO IC,HUANG CH.DNA vaccines for the prevention and treatment of allergy[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2009,9(1):50-54

[11]DUPUIS M,DENIS-MIZE K,WOO C,et al.Distribution of DNA vaccines determines their immunogenicity after intramuscular injection in mice[J].J Immunol,2000,165(5):2850-2858.

[12]OH YK,KIM JP,YOON H,et al.Prolonged organ retention and safety of plasmid DNA administered in polyethylenimine complexes[J].Gene Ther,2001,8(31):1587-1592.