張光英 綜述，程靜新 審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外三科，烏魯木齊 830011)

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·綜 述·

MiRNA-138靶向相關(guān)蛋白H2AX在腫瘤診治中的應(yīng)用價(jià)值*

張光英 綜述，程靜新△審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外三科，烏魯木齊 830011)

H2AX； 微小RNA； 腫瘤； 診斷； 治療敏感性

眾所周知，微小RNA(miRNA)通過與mRNA特異性結(jié)合而抑制其翻譯、降解等過程來控制細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激和凋亡，許多編碼miRNA的基因位置與癌癥發(fā)生變異位置重疊，在癌癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。應(yīng)用基因芯片篩選后發(fā)現(xiàn)，miRNA-138在宮頸鱗癌細(xì)胞中表達(dá)差異較為顯著，且在新疆維吾爾族宮頸鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，在宮頸癌新輔助化療后表達(dá)上調(diào)[1]。而H2AX作為miRNA-138靶向蛋白在腫瘤治療敏感性方面發(fā)揮重要作用，mir-138超表達(dá)直接靶點(diǎn)作用于H2AX 3′-UTR，減少H2AX的表達(dá)，誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定[2]，但miRNA-138通過抑制靶基因H2AX的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。H2A作為真核細(xì)胞特有的組蛋白是構(gòu)成染色質(zhì)的主要成分，H2A家族包括2個(gè)成員，H2AZ和H2AX[3]。

1 H2AX的活化與DNA損傷

H2AX基因位于11q23.2～q23.3，這一區(qū)域多數(shù)腫瘤基因缺失突變，尤其在造血系統(tǒng)腫瘤中最為顯著[4]。在人類細(xì)胞中，H2AX占H2A蛋白的比例從淋巴細(xì)胞中的2%到神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的20%不等。磷酸化的H2AX(γH2AX)是發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，除此之外，在不同的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)還可以發(fā)生乙?；?、甲基化、泛素化和最近發(fā)現(xiàn)的O-?；刃揎椃绞健?/p>

DNA損傷包括DNA加合物形成、DNA單鏈斷裂、雙鏈斷裂(DSBs)及堿基置換等反應(yīng)中的作用，各種理化因素及機(jī)體代謝產(chǎn)物都可以誘導(dǎo)DSBs而形成γH2AX。DNA損傷DSBs是最嚴(yán)重的DNA損傷。Olive[5]提出γH2AX在DNA損傷與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在基因組穩(wěn)定性下降，且DNA損傷是一些腫瘤藥物治療的重要靶點(diǎn)。DSBs修復(fù)能力可預(yù)測腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[6]，γH2AX作為DNA損傷相關(guān)蛋白在維持遺傳穩(wěn)定方面具有重要作用，為重要抑癌基因[7]。DSBs常與H2AX的活化同時(shí)存在，且熒光下γH2AX的焦點(diǎn)與 DSBs數(shù)量間有1∶1對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此γH2AX現(xiàn)已普遍作為DNA損傷的檢測指標(biāo)應(yīng)用，γH2AX是啟動(dòng)DSBs修復(fù)的關(guān)鍵因子，磷酸化的H2AX蛋白一方面可固定斷裂的DNA。另一方面可快速招募大量修復(fù)相關(guān)蛋白與信號(hào)分子參與DNA損傷的修復(fù)，且能在最初識(shí)別損傷信號(hào)傳導(dǎo)及DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究證實(shí)，γH2AX形成的焦點(diǎn)沒有細(xì)胞特異性，大多數(shù)組蛋白合成物與DNA復(fù)制通過獨(dú)特的信使核糖核酸緊密相連，特別是H2AZ和H3.3為獨(dú)立的DNA合成，而H2AX合成不尋常之處在于，它由部分DNA合成[9]。

2 γH2AX的檢測

γH2AX可以在剝脫的口腔上皮細(xì)胞中查到，它可通過患者的漱口水或用棉簽擦拭內(nèi)側(cè)面頰部獲得，剝脫的口腔細(xì)胞因取材簡單、無創(chuàng)被大力提倡，但有無核的鱗狀細(xì)胞及死亡細(xì)胞摻雜其中。最近的研究和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用粗細(xì)不等的毛發(fā)可使γH2AX在遺傳毒性藥物和輻射下可視化，使用毛發(fā)的一個(gè)主要優(yōu)勢是毛囊比外周淋巴細(xì)胞的DNA復(fù)制更容易受到癌癥藥物的攻擊。值得注意的是，部分皮膚活檢、毛囊細(xì)胞常常表現(xiàn)出最大γH2AX藥物治療后的反應(yīng)[10]。

免疫組化及印跡技術(shù)、彗星試驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)等均可檢測γH2AX，不同檢測方法各有利弊。免疫熒光法是最常用于檢測γH2AX的方法，不僅可直觀、形象地觀察到單個(gè)細(xì)胞中γH2AX的聚集，還能觀察到γH2AX與其他蛋白的作用情況。但不同條件下，γH2AX焦點(diǎn)大小和熒光強(qiáng)度可能發(fā)生變化。因此分析結(jié)果時(shí)，不僅要分析焦點(diǎn)的多少，還要考慮到焦點(diǎn)的大小及強(qiáng)度[11]；免疫印跡技術(shù)可定性分析γH2AX蛋白水平的變化，但它不能區(qū)分凋亡DNA損傷修復(fù)應(yīng)答產(chǎn)生的γH2AX，且通常敏感性不強(qiáng)僅用于基礎(chǔ)研究，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)因高靈敏度常用于臨床試驗(yàn)[12]；彗星試驗(yàn)更適合人口基礎(chǔ)研究，但不被采用于流行病學(xué)研究；已經(jīng)證明，流式細(xì)胞術(shù)方法檢測γH2AX的靈敏度是彗星試驗(yàn)的100倍，特別適用于檢測低水平的DNA損傷，且流式細(xì)胞技術(shù)可結(jié)合細(xì)胞周期來分析γH2AX水平的變化，但受單個(gè)細(xì)胞限制，它常用來評(píng)估DNA損傷與細(xì)胞周期之間的關(guān)系[13]，因此采用這種非常有效的流式細(xì)胞技術(shù)分析γH2AX可以更好地研究抗腫瘤藥物的應(yīng)用機(jī)制，對(duì)個(gè)體化用藥有重要指導(dǎo)意義。γH2AX分析可以用來推測對(duì)DSBs的易感性，亦可檢測未修復(fù)的DSBs[14]。因此，可結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)要求和各檢測優(yōu)缺點(diǎn)靈活運(yùn)用檢測技術(shù)。

3 γH2AX在腫瘤早期診斷方面的應(yīng)用

γH2AX對(duì)疾病早期診斷及發(fā)病機(jī)制的研究有重要應(yīng)用價(jià)值。已發(fā)現(xiàn)γH2AX在癌癥和癌前病變中表達(dá)顯著增加，可用于臨床診斷。許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與病毒感染密切相關(guān)，Jha等[15]在研究人外周血單核細(xì)胞卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染過程的基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了H2AX，幾乎所有基因都下調(diào)，敲除H2AX會(huì)導(dǎo)致卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒游離基因復(fù)制數(shù)量減少，γH2AX可能與病毒感染后蛋白鏈末端復(fù)制數(shù)量的增加有關(guān)。Matsuda等[16]在研究乙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞癌患者組織中發(fā)現(xiàn)，γH2AX表達(dá)量顯著增高，這與乙型肝炎病毒導(dǎo)致DNA損傷有關(guān)，可見γH2AX可作為有效生物學(xué)指標(biāo)來預(yù)測腫瘤的發(fā)生。同樣，林濤等[17]對(duì)正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸鱗癌組織病理切片中γH2AX表達(dá)陽性率分析發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒(HPV) DNA會(huì)逐漸整合到人宿主染色體而引起宿主DNA損傷，隨著宮頸病變的加重，γH2AX呈遞增趨勢，且γH2AX與HPV16 DNA表達(dá)部位相同，認(rèn)為γH2AX反映HPV復(fù)制相關(guān)的DNA損傷變化趨勢，從HPV病毒感染到腫瘤發(fā)生、發(fā)展，篩選此過程中表達(dá)差異明顯的蛋白，對(duì)宮頸癌早期診斷具有重要臨床價(jià)值。Risques等[18]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎、慢性炎性疾病易誘發(fā)大腸癌，經(jīng)歷這些慢性炎癥后細(xì)胞DNA損傷，提示γH2AX增加可反映氧化損傷。Matsuda等[16]對(duì)肺癌危險(xiǎn)性相關(guān)因素的研究，發(fā)現(xiàn)高比例的γH2AX與肺癌高危因素的增加有明顯相關(guān)性(OR=2.43)，這些患者患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)極大地增加。Pastukh等[19]發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺組織的線粒體基因組和特定序列核血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的啟動(dòng)子中有成簇的DNA損傷，γH2AX可促進(jìn)疾病發(fā)病機(jī)制的研究。另外，Scarpato等[20]發(fā)現(xiàn)，兒童肥胖常與慢性低級(jí)別炎癥相關(guān)，它可增加日后患某些類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，他們還分析了119名體質(zhì)量正常、體質(zhì)量超標(biāo)或肥胖兒童的淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量超標(biāo)或肥胖兒童淋巴細(xì)胞中γH2AX水平明顯高于體質(zhì)量正常的兒童。眾所周知，女性乳房是對(duì)輻射相當(dāng)敏感的器官，研究發(fā)現(xiàn)H2AX在乳腺X射線檢查時(shí)雖然表達(dá)量很小但前后變化較大[21]，這表明γH2AX有較高的靈敏度，可以用于評(píng)估不同檢查手段引起的DNA損害程度，評(píng)估輔助檢查利弊，這些都充分證明了H2AX有望成為疾病診斷的分子標(biāo)志物。

4 γH2AX在腫瘤放、化療敏感性方面的應(yīng)用

放、化療為腫瘤綜合治療的重要手段，尤其對(duì)腫瘤晚期或復(fù)發(fā)患者，如局部晚期及巨塊型宮頸癌治療療效較差、復(fù)發(fā)及病死率高，用子宮或髂內(nèi)動(dòng)脈局部注射化療藥物來減緩病灶發(fā)展，提高手術(shù)切除率，改善預(yù)后。很多化療藥物是通過誘導(dǎo)DSBs達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，如順鉑可以誘導(dǎo)復(fù)制阻滯最終導(dǎo)致DSBs的形成。治療癌癥化學(xué)藥物主要是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑,它能消除癌細(xì)胞誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，使組蛋白從開放的染色質(zhì)中離開[22]。藥物耐受導(dǎo)致腫瘤治療失敗仍是臨床治療的難題，尋找準(zhǔn)確、有效的方法檢測治療敏感性是研究者迫切關(guān)心的問題。

Kunos等[23]發(fā)現(xiàn)，沙利霉素通過增加DNA損傷來提高腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素和依托泊苷的敏感性并減少抗凋亡p21蛋白水平，沙利霉素與阿霉素、依托泊苷聯(lián)合治療后，γH2AX、p53BP1和pChk1的水平明顯升高并誘導(dǎo)焦點(diǎn)聚集。Ivashkevich等[24]研究骨髓增生異常綜合征(MDS)或急性髓系白血病(AML)患者中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑單獨(dú)或結(jié)合組蛋白去乙酰酶抑制劑的臨床療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)其外周血淋巴細(xì)胞γH2AX水平也明顯增加。Zolner等[25]研究表明，電離輻射可引起人類磷酸化位點(diǎn)突變從而中止ATM信號(hào)，致H2AX磷酸化受阻，DNA損傷修復(fù)質(zhì)量降低，達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的目的。Olive等[26]研究宮頸癌患者放療前后組織中γH2AX表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在接受1.8～2.5 Gy輻射劑量后，癌組織中γH2AX表達(dá)明顯升高，且高劑量輻射后組織中殘余γH2AX的焦點(diǎn)數(shù)高于低劑量組織。Goutham等[27]發(fā)現(xiàn)，隨著放療皮膚反應(yīng)和口腔黏膜炎等不良反應(yīng)的增加，淋巴細(xì)胞中剩余γH2AX焦點(diǎn)也增加，并認(rèn)為放療前行γH2AX聚集數(shù)目分析對(duì)放療不良反應(yīng)敏感者有預(yù)測價(jià)值。

Parikh等[28]研究頭頸部腫瘤發(fā)現(xiàn)，H2AFX基因11q23部分區(qū)域缺失，缺失H2AX基因的細(xì)胞株對(duì)藥物敏感性明顯增加，這為H2AFX作為抑癌基因抑制腫瘤提供依據(jù)。Solier等[29]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)由組蛋白H2AX和DNA損傷反應(yīng)蛋白組成的“凋亡環(huán)”厚殼，γH2AX對(duì)核基因氧化反應(yīng)損傷起到?jīng)Q定性作用。另外，研究者注意到兒童對(duì)輻射耐受量的較低，往往兒科輻射風(fēng)險(xiǎn)被低估，γH2AX可作為評(píng)估兒童輻射耐受量指標(biāo)，應(yīng)采取進(jìn)一步的安全措施減少或優(yōu)化兒童輻射治療。還有報(bào)道，血液單核細(xì)胞中形成和消失的γH2AX焦點(diǎn)在甲狀腺癌患者經(jīng)131I治療后個(gè)體間療效存在顯著差異[30]。此外，H2AX也廣泛應(yīng)用在體內(nèi)移植物上，如左心室起搏器(LVAD)患者淋巴細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂明顯增加且與γH2AX焦點(diǎn)在淋巴細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[31]。

H2AX轉(zhuǎn)錄調(diào)控反映細(xì)胞DNA修復(fù)要求,如在細(xì)胞分化晚期DNA修復(fù)中γH2AX是減少的,其分子機(jī)制是通過miRNA抑制H2AX。隨著年齡的增長，一些miRNA發(fā)生明顯變化，這些與年齡相關(guān)疾病的miRNA的靶基因?yàn)镻I3K、c-Kit和H2A，如miR-24調(diào)節(jié)H2AX的表達(dá)，使H2AX miR-24及蛋白在老年人中表達(dá)更高，這使H2AX并非局限在研究DNA損傷方面[32]。鑒于γH2AX與DNA損傷修復(fù)的關(guān)系，可以通過抑制其上游激酶而阻止H2AX磷酸化，或應(yīng)用輻射增敏劑，讓?duì)肏2AX持續(xù)存在，而使DNA損傷修復(fù)不能完成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療敏感性。因此，γH2AX水平可反應(yīng)基因組穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤監(jiān)測治療療效及尋找有效抗腫瘤藥物有重要臨床意義。

不僅γH2AX,其他組蛋白與腫瘤關(guān)系也十分密切，如組蛋白H3磷酸化(PPH3)表達(dá)水平與腫瘤直徑、雌激素受體和腫瘤分級(jí)有關(guān)。研究表明,45%的早期乳腺癌患者PPH3表達(dá)對(duì)乳腺癌預(yù)后可精確預(yù)測(96%),相反較低存活率(58%)的患者PPH3高表達(dá)，而在非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌組織中同樣存在異常H3和H4修飾[33]。

除此之外，γH2AX對(duì)疾病預(yù)后等研究也有重要臨床價(jià)值。如與正常組織相比，γH2AX在黑色素瘤細(xì)胞或癌前病變(痣)中高強(qiáng)度表達(dá)，但似乎并不能作為黑色素瘤預(yù)后的指標(biāo)[34]。然而，γH2AX可以作為一種診斷工具，從發(fā)育異常的痣中分辨黑色素瘤。

5 結(jié) 語

當(dāng)今，惡性腫瘤是危害人類健康主要疾病之一，位居我國十大疾病致死率之首[35]。中晚期腫瘤患者藥物治療失敗使其生存率大大降低，γH2AX可作為檢測腫瘤治療敏感性的指標(biāo)，對(duì)改變腫瘤預(yù)后起關(guān)鍵作用。大多數(shù)化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞有較高的毒性，因此限制了其臨床應(yīng)用。確定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞高度敏感，但對(duì)健康細(xì)胞有最小有害影響是研發(fā)腫瘤化療藥物的重要挑戰(zhàn)。外周血與組織中γH2AX水平非常接近，且取材方便、可重復(fù)行高，有望成為化療藥物療效的即時(shí)監(jiān)測方法。γH2AX因可通過轉(zhuǎn)錄后修飾(PTMs)來動(dòng)態(tài)調(diào)整細(xì)胞壓力，近年來，組蛋白PTMs潛在臨床應(yīng)用與藥物開發(fā)有關(guān)，有前途的化合物修飾染色質(zhì)被引入新的抗癌藥物[36]，希望通過miRNA及其靶蛋白生物信號(hào)通路機(jī)制深入研究，能發(fā)現(xiàn)更為有效的藥物治療腫瘤。盡管有許多新抗癌藥物被成功發(fā)現(xiàn),但只有5%的預(yù)測藥物獲得最終批準(zhǔn)，γH2AX作為新生物標(biāo)記物可減少抗腫瘤藥物研發(fā)的時(shí)間和成本。研制敏感、有效的抗癌藥物是研究者們最關(guān)心的問題。值得注意的是，因腫瘤異質(zhì)性血管化和基因組成的差異可能會(huì)影響γH2AX形成和移除,因此γH2AX反應(yīng)可能在同一患者的不同轉(zhuǎn)移瘤及同一瘤體中的不同細(xì)胞表達(dá)有差異，所以關(guān)于H2AX在腫瘤的診斷及治療方面的應(yīng)用有待于更深入的研究。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.052

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1672-9455(2015)07-0994-03

2014-11-10

2014-12-20)