程瑩+魯永織+孫敏+張卓琦

基金項(xiàng)目本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金（No.30800219，No.30670557），江蘇省高校自然科學(xué)基金（No.08KJD320013）和徐州醫(yī)學(xué)院院長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)人才基金（No.07KJZ26）資助

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.22.2

摘要目的：探討阿托伐他?。ˋtv）在轉(zhuǎn)錄水平的抗炎作用機(jī)制。方法：將構(gòu)建好的含有人類(lèi)TNF-α啟動(dòng)子的以蟲(chóng)熒光素酶（Luciferase）為報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞中，以AngⅡ刺激并經(jīng)不同濃度的Atv處理后，通過(guò)檢測(cè)Luciferase的活性來(lái)觀察啟動(dòng)子活性的變化。結(jié)果：?jiǎn)?dòng)子在VSMCs中可高效穩(wěn)定的表達(dá)；而經(jīng)AngⅡ刺激的VSMCs中，TNF-α啟動(dòng)子活性較未受刺激時(shí)明顯上調(diào)（P<0.05）。在VSMCs中0.1～10μmol/L的Atv可抑制經(jīng)AngⅡ刺激后上調(diào)表達(dá)的TNF-α啟動(dòng)子活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：Atv對(duì)TNF-α啟動(dòng)子活性的抑制，證明了其對(duì)促炎細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄水平的潛在抑制作用。

關(guān)鍵詞阿托伐他??；血管平滑肌細(xì)胞；腫瘤壞死因子；炎性反應(yīng)

Study of the effect of atorvastatin on the transfection of TNF-αpromoter activity in vascular smooth muscle cell

Cheng Ying1，Lu Yongzhi2，Sun Min1，Zhang Zhuoqi1

Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College（Xuzhou City，Jiangsu），2210021

The Second Department of Oncology，the Municipal Hospital of Qingdao City，Shandong 2660112

Fundation itemThis project was supported by the national natural science foundation of China（No.30800219， No.30670557）， the college natural science foundation of Jiangsu Province（No.08KJD320013） and dean special talent fund（No.07KJZ26）

AbstractObjective：To explore the anti-inflammatory action mechanism on transcriptional level of atorvastatin（Atv）.Methods： The plasmid DNA had luciferase as the reporter gene and human TNF alpha promoter.The plasmid DNA was transfected to smooth muscle cell in vitro culture.It was stimulated by AngⅡand disposed by different concentrations of Atv.The change of the promoter activity was observed by detecting the activity of Luciferase.Results：The promoter could highly efficient and stable expression in VSMCs.While VSMCs was stimulated by AngⅡ，TNF-αpromoter activity was obviously up-regulated than without stimulation（P<0.05）.0.1～10μmol/L Atv could inhibit the higher expression of TNF-αpromoter activity in VSMCs，and it was a dose-dependent manner（P<0.05）.Conclusion：The inhibition of Atv on the TNF-αpromoter activity proves its potential inhibition of proinflammatory cytokines at transcriptional level.

Key wordsAtorvastatin；Vascular smooth muscle cell；Tumor necrosis factor；Inflammatory response

細(xì)胞因子在機(jī)體炎性反應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并參與多種心血管疾病的生理病理過(guò)程，包括動(dòng)脈粥樣硬化及心衰等[1]。目前研究較多的是TNF-α，它由多種細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成并通過(guò)自分泌和旁分泌作用，參與炎性反應(yīng)[2]。阿托伐他汀為HMG-CoA還原酶選擇性抑制劑，能夠減低血漿膽固醇及脂蛋白水平，從而被應(yīng)用于冠心病的治療中，發(fā)揮調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊等作用。近年來(lái)亦有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎作用[3]，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究以體外培養(yǎng)的VSMCs為系統(tǒng)，初步探討阿托伐他汀對(duì)TNF-α啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平研究其抗炎機(jī)制。

資料與方法

主要試劑：阿托伐他汀原藥粉（Pfizer，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，澳大利亞）；高糖型DMEM（Hyclone，美國(guó)）；BCA蛋白試劑盒；BgIⅡ和MluⅠ核酸內(nèi)切酶；Lipofectamine2000試劑（Invitrogen，美國(guó)）；熒光素酶試劑盒（Promega，美國(guó)）；兔抗TNF-α多克隆抗體及馬抗鼠堿性過(guò)氧化物酶抗體。

實(shí)驗(yàn)方法：①細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊貼壁法，雄性SD大鼠，購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院主校區(qū)動(dòng)物房，體重150～200 g，水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后，無(wú)菌狀態(tài)取出胸主動(dòng)脈，7～10天后待原代培養(yǎng)VSMCs長(zhǎng)成“峰-谷”樣形態(tài)后，收獲并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)采用第五代細(xì)胞。所有細(xì)胞均在含10% FBS的DMEM，5%CO2 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②Western Blot檢測(cè)：阿托伐他汀對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中TNF-α基因的表達(dá)的影響采用Western Blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、AngⅡ刺激組、AngⅡ+10μmol/L Atv組、AngⅡ+1μmol/L Atv組、AngⅡ+ 0.1μmol/L Atv組。作用24小時(shí)后，按照試劑盒操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。進(jìn)行SDS-PAGE，用特異性抗TNF-α抗體進(jìn)行免疫雜交檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參照，化學(xué)發(fā)光劑顯色，最后對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描機(jī)密度分析。每組重復(fù)3次。③質(zhì)粒酶切電泳：驗(yàn)證其是否為含有人類(lèi)TNF-α基因啟動(dòng)子的以蟲(chóng)熒光素酶（Luciferase）為報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA。按內(nèi)切酶產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)的酶切體系分質(zhì)粒組、質(zhì)粒+MluⅠ/BglⅡ單一內(nèi)切酶組、質(zhì)粒+MluⅠ+BglⅡ雙內(nèi)切酶組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。④Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：VSMCs以5×104cells/well接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80～90%融合時(shí)，嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。⑤Luciferase檢測(cè)：轉(zhuǎn)染步驟同上，過(guò)夜后，各組分別按要求加入10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L的Atv，30分鐘后除空白組及質(zhì)粒組，其余4組均加入終濃度1μmol/L的AngⅡ，作用24小時(shí)后，以50μl/孔的細(xì)胞裂解液（1×PBS，0.1%Triton X-100，蛋白酶抑制劑）收取細(xì)胞，4℃離心15分鐘，取20μl上清液，以熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega）在FB 12Luminometer檢測(cè)luciferrase活性，啟動(dòng)子活性即以RLU（relativelight unit）表示，由儀器直接讀出測(cè)定值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SSPS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA），顯著性水準(zhǔn)P取0.05。

結(jié)果

阿托伐他汀對(duì)AngⅡ刺激下大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)的影響：Western Blot結(jié)果顯示，與空白組相比，經(jīng)終濃度1μmol/L的AngⅡ刺激后，TNF-α蛋白表達(dá)增加；阿托伐他汀不同劑量組（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）均對(duì)AngⅡ刺激下大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)有一定的抑制作用，其中以10μmol/L的阿托伐他汀對(duì)AngⅡ刺激下TNF-α蛋白表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)，呈劑量依賴性，見(jiàn)圖1。

TNF-α啟動(dòng)子在VSMCs的活性表現(xiàn)及阿托伐他汀對(duì)其活性影響：為進(jìn)一步研究Atv抗炎作用機(jī)制，將構(gòu)建好的含有TNF-α啟動(dòng)子基因和Luciferase基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的VSMCs中，以AngⅡ刺激并經(jīng)不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的Atv預(yù)處理后，通過(guò)檢測(cè)Luciferase的活性來(lái)觀察TNF-α啟動(dòng)子活性的變化。結(jié)果顯示：空白組無(wú)Luciferase的表達(dá)，RLU值幾乎為0；AngⅡ組為經(jīng)終濃度為1μmol/L的AngⅡ刺激后，激活TNF-α啟動(dòng)子基因，導(dǎo)致Luciferase活性較質(zhì)粒組明顯增加（P<0.01）；Atv+AngⅡ組為Atv可抑制經(jīng)AngⅡ刺激后明顯上調(diào)的Luciferase的表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P<0.05 ），見(jiàn)圖2。

討論

炎性反應(yīng)已經(jīng)被公認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制[4-5]，同時(shí)也使得斑塊的不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致斑塊破裂[6]。炎性細(xì)胞及炎性因子為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的重要組成部分。炎性反應(yīng)介導(dǎo)多種危險(xiǎn)因素參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。血管內(nèi)皮受損后，促炎細(xì)胞的關(guān)鍵因子TNF-α可被激活，它由多種細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成并通過(guò)自分泌和旁分泌作用，發(fā)揮多種病理生理效應(yīng)[7-8]。因此，多種旨在針對(duì)TNF-α的治療措施均起到一定的抑制炎性反應(yīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建好的含人類(lèi)TNF-α基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒DNA，經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的VSMCs中，由于luciferrase檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度較高且其表達(dá)比較穩(wěn)定，彌補(bǔ)了轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低的不足，因此可作為研究各種信號(hào)調(diào)控TNF-α基因轉(zhuǎn)錄的良好平臺(tái)。本研究證實(shí)，在VSMCs中，體外轉(zhuǎn)染的TNF-α啟動(dòng)子可高效穩(wěn)定的表達(dá)；而經(jīng)AngⅡ刺激的VSMCs中，TNF-α啟動(dòng)子活性呈明顯上調(diào)（P<0.05），直接證明了兩者參與炎性反應(yīng)的可能機(jī)制以及對(duì)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。

阿托伐他汀作為冠心病治療中的調(diào)脂藥物，其抗炎作用已在相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道[9-10]。本研究表明，阿托伐他汀對(duì)VSMCs體外轉(zhuǎn)染的TNF-α啟動(dòng)子活性產(chǎn)生明確的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P<0.05）。從轉(zhuǎn)錄水平證明了其抗炎作用。然而，阿托伐他汀發(fā)揮其抑制TNF-α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這種抑制作用是否針對(duì)TNF-α是特異性的尚不十分明確，仍需進(jìn)一步研究。

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