陳 峰，張 韜，郭 偉解放軍總醫(yī)院 血管外科，北京 00853；北京大學(xué)人民醫(yī)院 血管外科，北京 00044

動(dòng)脈粥樣硬化引起的外周動(dòng)脈疾病(peripheral arterial disease，PAD)是僅次于冠心病和卒中的最常見的血管疾病，全球70歲以上人群患病率超過了10%[1]。對(duì)于PAD患者的管理，目前美國(guó)心臟病學(xué)學(xué)院基金會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)指南推薦的手段主要是基礎(chǔ)治療和手術(shù)治療，手術(shù)治療借助于動(dòng)脈旁路移植術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)/支架置入術(shù)[2]。無論哪種手術(shù)方法，都存在20%～30%的血管再狹窄(restenosis，RS)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響該病治療的遠(yuǎn)期療效[3-4]。RS發(fā)生的核心機(jī)制之一為炎性細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在趨化因子，如趨化素樣因子1(chemokine like factor 1，CKLF1)、單核細(xì)胞趨化因子1(macrophage chemoattractant protein 1，MCP-1)、Fractalkine等介導(dǎo)下的遷移[5-7]。CKLF1是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心應(yīng)用抑制性減數(shù)雜交技術(shù)克隆出的一個(gè)新細(xì)胞因子，與MCP-1在結(jié)構(gòu)上具有同源性[6,8]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有廣譜的趨化活性，而且能夠促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞、骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化[8-9]，與心血管疾病也存在著密切關(guān)聯(lián)[10-11]。傳統(tǒng)研究方法發(fā)現(xiàn)CKLF1具有誘導(dǎo)VSMC增殖和抗凋亡的雙重作用[12]，還能促進(jìn)VSMC定向遷移[13]。本文主要介紹CKLF1在RS形成過程中的作用機(jī)制，并綜述既往相關(guān)的體外遷移研究實(shí)驗(yàn)。

1 CKLF1在RS病程中的作用

近半個(gè)世紀(jì)以來，對(duì)RS機(jī)制的探究始終未曾停止。多數(shù)研究認(rèn)為，炎癥損傷和免疫反應(yīng)貫穿于整個(gè)病變過程，血管重建造成了內(nèi)皮損傷，病變處血管的擴(kuò)張或全層離斷使中膜彈性纖維層的破壞延伸到外膜，血管壁損傷會(huì)導(dǎo)致局部微血栓形成和炎癥反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)而在眾多細(xì)胞因子[(MCP-1、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)]的作用下使VSMC過度增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增多并同VSMC一起向內(nèi)膜遷移，最終共同構(gòu)成了增生的內(nèi)膜組織，引起了RS的發(fā)生[14-20]。

趨化因子是一類調(diào)控細(xì)胞定向遷移的重要細(xì)胞因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為C、CC、CXC、CX3C亞族。目前，已發(fā)現(xiàn)與RS相關(guān)的趨化因子主要包含CC亞族中的MCP-1/MCAF、MIP-1α、MIP-1β，CXC亞族中的PAF、IL-8、GRO以及CX3C家族的Fractalkine等，其受體(XCR1、CCR1 ~ 11、CXCR1 ~ 5和CX3CR1)多屬于G蛋白偶連受體超家族[6-7]。新細(xì)胞因子CKLF1具有CC家族趨化因子的特征性結(jié)構(gòu)，通過HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其受體之一是CCR4[21]。CKLF1不僅能夠趨化嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，而且可以刺激小鼠骨骼肌細(xì)胞的增殖，以及促進(jìn)人和小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化[8-9]。有報(bào)道稱其還能調(diào)控單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CKLF1可以改善大鼠急性心肌梗死后心臟功能，有助于心肌修復(fù)[23]。目前CKLF1與血管疾病關(guān)聯(lián)的研究較少。筆者之前的研究中[24]推測(cè)CKLF1協(xié)同基質(zhì)金屬蛋白酶參與了腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病，氫水治療可以有效阻斷前述病理進(jìn)程。宣成睿等[13,25]分別發(fā)現(xiàn)人CKLF1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS7和293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)VSMC具有趨化和促增殖作用，且該作用依賴于Gi蛋白偶聯(lián)受體。同樣的促增殖和遷移作用也表達(dá)在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上，推測(cè)CKLF1具有促進(jìn)新生血管形成的功能[26]。CKLF1與MCP-1在結(jié)構(gòu)上具有同源性，且在大鼠主動(dòng)脈損傷模型中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜組織中CKLF1與MCP-1在表達(dá)上存在高度正相關(guān)性，提示CKLF1在RS過程中可能與MCP-1發(fā)揮相似的功能[27]。

在對(duì)CKLF1促進(jìn)VSMC遷移作用的系列研究中，多位研究人員均證實(shí)CKLF1參與了VSMC遷移過程，是發(fā)生RS的危險(xiǎn)因素：1)人動(dòng)脈硬化斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC和巨噬細(xì)胞皆可表達(dá)CKLF1，其表達(dá)量較正常動(dòng)脈顯著上調(diào)，斑塊中CKLF1、巨噬細(xì)胞和VSMC共定位存在，推測(cè)CKLF1在招募炎癥細(xì)胞，刺激VSMC遷移等RS關(guān)鍵步驟上可能起到了某種特殊的作用[12,28]。2)通過腺病毒和shRNA技術(shù)干擾CKLF1基因表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CKLF1促VSMC遷移功能分別得到增強(qiáng)和減弱，在大鼠頸動(dòng)脈局部損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)應(yīng)的內(nèi)膜增生變化趨勢(shì)與體外實(shí)驗(yàn)一致[28]。3)通過CKLF1的小分子多肽C19和化合物抑制劑S009阻斷VSMC上的CCR4受體，發(fā)現(xiàn)CKLF1引起的作用發(fā)生了改變[29]，提示CCR4是CKLF1的受體之一，這一現(xiàn)象與王應(yīng)和馬大龍[21]的研究結(jié)論基本一致。4)VSMC轉(zhuǎn)染CKLF1后，內(nèi)含核因子(nuclear factor，NF)-κB的表達(dá)總量被增強(qiáng)，推測(cè)NF-κB信號(hào)通路參與了CKLF1介導(dǎo)VSMC生物學(xué)功能的調(diào)控[30]。由此可見，CKLF1在RS的發(fā)展過程中起了重要作用，遺憾的是，目前CKLF1對(duì)VSMC作用機(jī)制尚無更深入研究，如受體變化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、表型轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)錄因子等層面，因而制約了其藥物拮抗靶點(diǎn)和臨床應(yīng)用價(jià)值的開發(fā)利用。

2 體外遷移實(shí)驗(yàn)

在CKLF1對(duì)RS發(fā)生機(jī)制的研究中，VSMC遷移是基本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｓ绊慥SMC遷移的因素很多，包括各種生長(zhǎng)因子、趨化因子、流體應(yīng)力等。為探索多因素介導(dǎo)VSMC遷移的機(jī)制，重復(fù)性好、可信度高的體外研究是十分必要的。傳統(tǒng)研究中VSMC遷移主要依賴于劃痕法和細(xì)胞趨化小室(Boyden Chamber)等經(jīng)典技術(shù)。前者是在孔板上，當(dāng)VSMC貼壁長(zhǎng)滿時(shí)用移液槍頭或刀片刮除一定范圍的細(xì)胞，觀察細(xì)胞向刮除細(xì)胞區(qū)的遷移運(yùn)動(dòng)。一般以某一細(xì)胞群的最大遷移距離為參數(shù)分析VSMC遷移能力。該方法操作簡(jiǎn)單，直觀，備受實(shí)驗(yàn)人員青睞，但其劃痕速度和尺寸一致性較差。在劃痕過程中，細(xì)胞受到機(jī)械性損傷，并釋放細(xì)胞內(nèi)容物于周圍環(huán)境，且細(xì)胞損傷程度不可控，導(dǎo)致遷移過程復(fù)雜多樣。另外，瓶皿表面修飾分子層會(huì)被劃痕破壞，上述問題說明該技術(shù)可重復(fù)性較差。后者以8μm孔徑濾膜為分界，將VSMC接種至上層小室，下室加入不同誘導(dǎo)物，于不同時(shí)間點(diǎn)取出濾膜擦掉膜正面的細(xì)胞后，固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)膜背面視野中的細(xì)胞數(shù)，也可以在電鏡下觀察VSMC跨膜的過程。但細(xì)胞趨化小室技術(shù)只能模擬VSMC在單一濃度、穩(wěn)態(tài)溶液環(huán)境中的反應(yīng)，而體內(nèi)環(huán)境中VSMC遷移是一個(gè)多因素調(diào)控的復(fù)雜病理生理學(xué)過程。更為重要的是，相對(duì)于血管壁的微小尺寸，這些胞外環(huán)境與體內(nèi)微環(huán)境差異十分明顯，客觀上難以真實(shí)反映生理狀態(tài)下VSMC的生物學(xué)特征。因此，需要能更好模擬活體血管壁微環(huán)境并具有對(duì)活細(xì)胞從時(shí)間上和空間上進(jìn)行精確操作的細(xì)胞研究裝置。

微流控芯片又稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”，是通過半導(dǎo)體集成技術(shù)制成的新型固體元件，可對(duì)微量流動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜、精確的操作，該項(xiàng)技術(shù)與基因芯片技術(shù)并稱為21世紀(jì)最有發(fā)展前景的新技術(shù)。在基于微流控技術(shù)的細(xì)胞研究領(lǐng)域中，早在2006年《Nature》上就有針對(duì)微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的相關(guān)綜述：包括芯片材料選擇、建立微環(huán)境、片上培養(yǎng)、細(xì)胞檢測(cè)等[31]。2014年《Nature》上進(jìn)一步綜述微流控技術(shù)在腫瘤細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等領(lǐng)域的重要應(yīng)用[32]。在基于微流控技術(shù)的細(xì)胞遷移研究中，Whitesides最早提出利用微流控技術(shù)的層流特性，在微溝道中產(chǎn)生溶液濃度梯度和束縛在襯底上的大分子密度梯度[33-34]。其優(yōu)勢(shì)是梯度定量可控，不僅產(chǎn)生線性梯度而且可以產(chǎn)生穩(wěn)定多樣的梯度，更好地模擬細(xì)胞微環(huán)境。使用這一技術(shù)，量化了炎癥細(xì)胞[35]、腫瘤細(xì)胞[36-37]、小腸上皮細(xì)胞在不同梯度下的遷移[38]。Wong在Whitesides設(shè)計(jì)的“圣誕樹”結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過控制交聯(lián)劑濃度梯度實(shí)現(xiàn)了束縛于襯底表面的硬度梯度[39]。Ladoux使用微流控技術(shù)制作微陣列，通過調(diào)整微柱的尺寸，同樣實(shí)現(xiàn)了襯底表面的硬度梯度[40]。Du等[41-42]化繁為簡(jiǎn)，摒棄了傳統(tǒng)微流控技術(shù)中的導(dǎo)管和泵，采用滑動(dòng)芯片法，在微溝道中產(chǎn)生溶液濃度梯度。與傳統(tǒng)方法比較，微流控技術(shù)不僅可以“真實(shí)”模擬細(xì)胞外環(huán)境，還能構(gòu)建細(xì)胞級(jí)精度的濃度梯度、分子密度梯度、硬度梯度等，成為細(xì)胞層面機(jī)制研究的優(yōu)勢(shì)平臺(tái)。

3 結(jié)語

CKLF1在RS的病理過程中具有重要作用，CKLF1調(diào)控VSMC遷移過程，是發(fā)生RS的危險(xiǎn)因素。然而，CKLF1對(duì)VSMC的研究尚無深入到受體變化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、表型轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)錄因子等層面，現(xiàn)象表征的模型缺陷也制約了VSMC在趨化因子作用下遷移機(jī)制的研究，此方面空白亟需填補(bǔ)，以期對(duì)RS的治療開拓新的思路和方案，并且基于高通量方法，可以提高體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行心血管藥物篩選的成功率。

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